Avaliação do Nível e Relevância Prognóstica de Novos Marcadores de Neuroinflamação na Hemorragia Subaracnóidea (ESA-MICROPN)

A hemorragia subaracnóidea (HSA) consiste no extravasamento de sangue para o espaço entre a aracnóide e a pia-máter. O sangramento é consequência da ruptura do aneurisma cerebral na maioria dos casos. Afeta principalmente mulheres com idade média de 55 anos. Apesar da incidência ser de apenas 9 casos em 1.000 pessoas por ano, a idade jovem e a alta mortalidade e morbidade levam à perda de vários anos de vida saudável. Na verdade, os pacientes que sobreviveram à ruptura do aneurisma cerebral sofrem de déficits cognitivos, distúrbios de comportamento e são incapazes de voltar ao seu antigo nível de produtividade e empregos. As prioridades terapêuticas são: prevenir ressangramento, com tratamento endovascular (quando possível) ou clipagem neurocirúrgica do aneurisma; prevenir as complicações associadas ao extravasamento de sangue para o ritmo subaracnóideo, como o tratamento da hidrocefalia aguda (que ocorre em 20% dos pacientes), pelo posicionamento da drenagem ventricular externa, e a isquemia cerebral tardia, principalmente por vasoespasmo, pela administração endovenosa de nimodipina; manutenção da pressão de perfusão ideal. Do ponto de vista fisiopatológico, após dano mecânico precoce, causado por ruptura de aneurisma (devido à destruição tecidual consequente a efeito de massa hemorrágico, hidrocefalia aguda, herniação ou possível hematoma intraparenquimatoso), pode desenvolver-se dano subagudo de três a quatorze dias pós-hemorragia , devido à isquemia cerebral tardia. Os principais responsáveis ​​por esse evento são o vasoespasmo, que complica 20-30% da HAS, a disfunção da microcirculação e o microtromboembolismo. A patogênese do dano secundário não é clara, mas a inflamação e a apoptose endotelial parecem estar envolvidas no desenvolvimento do vasoespasmo. Além disso, alguns estudos demonstram que pacientes com disfunção neurológica aguda apresentam maior risco de falência de órgãos, principalmente de pulmões e rins.

A osteopontina (OPN) é uma glicoproteína secretada da matriz extracelular que desempenha diversos papéis em processos fisiológicos e patológicos, como remodelamento tecidual, fibrose, migração celular, inibição da apoptose e inflamação. Acredita-se que a OPN endógena cumpra uma atividade protetora sobre danos isquêmicos tanto no cérebro quanto em outros órgãos, incluindo rins. Além disso, a administração de OPN recombinante diminui acentuadamente a área isquêmica em modelo de isquemia cerebral focal, por ação antiapoptótica. Recentes estudos in vivo em modelos animais de HAS demonstraram que a OPN desempenha um papel importante; sua administração atenua o dano cerebral diminuindo a metaloproteinase 9 e inibindo a óxido nítrico sintase induzível. O tratamento com OPN também parece prevenir o vasoespasmo, induzindo um inibidor endógeno de proteína ativada por mitógeno (MAP), ou seja, MAP quinase fosfatase 1 e reduzindo a apoptose das células musculares lisas e das células endoteliais. Um outro campo de pesquisa nesta área diz respeito às micropartículas, ou seja, mediadores liberados por plaquetas, leucócitos, eritrócitos e células endoteliais. Ao contrário do que se pensava, eles não representam uma forma de resíduo de células de coagulação apoptótica e estudos recentes mostram sua atividade parácrina e reguladora. No AVC isquêmico, os níveis de micropartículas endoteliais estão diretamente relacionados à gravidade clínica e à extensão da área isquêmica. Na hemorragia parenquimatosa típica, os níveis de micropartículas são mais elevados tanto no sangue quanto no líquor e estão associados a pior evolução clínica. Na HAS foi demonstrado aumento dos níveis de micropartículas, especialmente no dia do sangramento, e os níveis de micropartículas mudam com base no tipo. Por outro lado, os dados discordam entre os trabalhos sobre os tipos envolvidos nas flutuações e seu curso de tempo: Lackner et al. avaliaram 20 pacientes com HAS (Fisher II, III e IV) em seus primeiros quinze dias de sangramento e encontraram níveis sanguíneos mais elevados de micropartículas de plaquetas, endoteliais, eritrócitos e leucócitos em comparação com controles saudáveis ​​[28]. Além disso, os marcadores de tipo endotelial positivo para agrupamento de diferenciação (CD) 105 e CD 62 foram particularmente aumentados em pacientes afetados por vasoespasmo, documentados com doppler. A isquemia associada ao vasoespasmo também apresenta níveis especialmente elevados de micropartículas CD 41 positivas de plaquetas. Apesar do grau de incapacidade no momento da alta, os níveis de micropartículas são maiores em comparação com pacientes totalmente recuperados (n=11). Mais recentemente, Sanborn et al. estudo em 22 pacientes com HAS com disseminação maciça de sangue (Fisher III e IV) confirma níveis de elevação de micropartículas nesses pacientes. Verifica-se também elevação dos níveis de micropartículas endoteliais e plaquetárias, não havendo correlação com evidência de vasoespasmo, tanto em ultrassom (velocidade média maior que 125 cm/s na circulação anterior ou maior que 100 cm/s na circulação posterior, além de relação de Lindegaard maior que 3) e angiografia.

Os dados publicados não são unânimes sobre a correlação entre vasoespasmo e evidências tomográficas de isquemia ou incapacidade.

O endpoint primário do estudo é avaliar:

1) a correlação entre os níveis de OPN e micropartículas e o desenvolvimento de vasoespasmo/lesão isquêmica na tomografia computadorizada e, posteriormente, com a evolução dos pacientes a médio e longo prazo.

Os endpoints secundários foram:

1. Alterações na quantidade de OPN no líquor e no sangue de pacientes com HSA no dia do sangramento e pós-hemorragia, ou seja, dias 1, 2, 3, 5, 7, 9, 11.
2. Níveis de micropartículas em pacientes com líquor e sangue com HSA no dia do sangramento e pós-hemorragia, ou seja, dias 1, 2, 3, 5, 7, 9, 11, a fim de avaliar seu valor preditivo para vasoespasmo e a correlação com piora da função pulmonar e desfecho em 3-6 meses.
3. Micropartículas isoladas serão utilizadas para ativar in vitro células endoteliais renais e pulmonares com o objetivo de evidenciar um possível cross talk, analisando marcadores de dano endotelial.

A duração do recrutamento será de um ano. Na entrada do hospital, uma tomografia computadorizada será realizada, bem como a pontuação de Fischer, pontuação de Hunt e Hess e pontuação da Federação Mundial de Cirurgiões Neurológicos (WFNS). Registraremos variáveis ​​demográficas, ou seja, idade, sexo, sintomas de início e comorbidade.

A angiografia ou angio-TC será realizada de acordo com a melhor prática clínica para documentar a presença, dimensão e características do aneurisma pérvio. O tratamento dos pacientes com HAS será realizado como prática clínica de rotina. Os pacientes serão monitorados com doppler transcraniano a partir do dia I e clinicamente todos os dias. Caso não ocorra nenhuma alteração clínica, os pacientes serão submetidos a uma angiotomografia de perfusão ou angiografia no dia 7 (+/- 1 dia). Em caso de piora do quadro clínico ou aumento da velocidade do doppler (considerando vasoespasmo leve quando velocidade média dentro da artéria cerebral 120-150 cm/s, moderada 150-200 cm/se grave >200 cm/s), angiografia e nimodipina endovascular serão considerados, de acordo ao protocolo padrão de terapia. O vasoespasmo angiográfico consiste no estreitamento das artérias cerebrais confirmado pelo neurorradiologista. Vasoespasmo clínico é definido como deterioração da consciência (redução de 2 pontos na escala de coma de Glasgow (GCS)) e/ou surgimento de novo déficit focal, após exclusão de outras causas, como convulsão, ressangramento, febre. Cada nova evidência de isquemia na TC será registrada a partir do dia 3.

Aos 3-6 meses, o resultado será avaliado por GOS-E (escala de coma estendida de Glasgow; escala de 8 pontos, desde a morte até a boa recuperação superior, sem nenhuma incapacidade deixada relacionada à HSA). Para obter essas informações, a equipe treinada entrevistará o próprio paciente ou um parente próximo.

As amostras biológicas serão coletadas na admissão, ou seja, dentro de 24 horas após o sangramento e nos dias 1, 2, 3, 5, 7, 9, 11. O licor estéril será coletado da bolsa distal à câmara de coleta, em uma quantidade de 10 ml/molde, no mesmo horário todos os dias. Sangue na quantidade de 3 ml/dado e urina serão coletados no mesmo horário (por volta das 7h). Licor, plasma e urina serão centrifugados (2500 rpm por 30 minutos) e os sobrenadantes serão aliquotados e congelados à temperatura de -80°C até a análise. A análise de OPN será realizada com kit comercial de ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA), seguindo a sugestão do fabricante (AssayDesigns Inc., Michigan; Pierce Biotechnology Inc., Rockford, IL). Para melhor descrever a resposta inflamatória, as principais citocinas T helper 1 (Th)1 e Th2 serão medidas, bem como marcadores de dano cerebral (enolase neuron specific (NSE), dimetilarginina assimétrica (ADMA) etc.). Na urina, os marcadores de comprometimento pré-clínico precoce serão quantificados. O isolamento e caracterização das micropartículas serão realizados com Nanosight com base em dimensão e concentração, enquanto os principais antígenos de superfície serão identificados em citofluorimetria, especificando a proveniência: leucócitos, eritrócitos, plaquetas, células endoteliais. A análise in vitro será realizada em monocamada de células endoteliais pulmonares e renais. Balanço hídrico, creatinina, número de leucócitos, infecção/colonização, drogas nefrotóxicas serão monitorados diariamente.

O efeito das micropartículas será avaliado in vitro em células endoteliais de cordão umbilical (HUVEC), em células musculares lisas (SMC), em células endoteliais pulmonares e renais, incubadas com e sem micropartículas purificadas derivadas de plasma de pacientes. Além disso, serão realizadas análises para avaliar: apoptose (coloração de túnel), angiogênese (evidência de estruturas semelhantes a capilares na placa Matrigen), adesão de leucócitos e expressão de moléculas de adesão.

Como não há dados na literatura sobre os níveis de OPN durante a HAS e os dados sobre micropartículas não são unânimes, não foi calculado um tamanho amostral real. Considerando que se esperava que 20%-30% dos pacientes fossem complicados com vasoespasmo, a inscrição foi planejada com 60 pacientes em um ano para obter 12-18 pacientes com vasoespasmo. Os participantes que atenderem aos critérios de inclusão e exclusão serão inscritos na UTI e na ala de neurocirurgia de Novara Ospedale Maggiore della Carità no período de um ano (ou seja, 31 de janeiro de 2018, 30 de janeiro de 2019). Com base nas internações do ano passado, são esperados 20 pacientes na UTI e 40 pacientes na enfermaria de Neurocirurgia. Em T0, os níveis de micropartículas serão analisados ​​em pacientes com e sem vasoespasmo com o teste de classificação de Wilcoxon. Com equações de vapor generalizadas, os níveis de micropartículas serão comparados entre pacientes com e sem vasoespasmo ou novos eventos isquêmicos. GOS-E de 3 e 6 meses será comparado pelo teste de Kruskal-Wallis. A relação entre o número de micropartículas e a incidência de vasoespasmo e isquemia será definida pela correlação de Spearman. Um valor de p inferior a 0,05 será o limite para significância estatística. A análise será realizada com o STATA. No que diz respeito aos experimentos in vitro, serão realizados testes não paramétricos.