Az új ideggyulladás markerek szintjének és prognosztikai relevanciájának értékelése szubarachnoidális vérzésben (ESA-MICROPN)

A subarachnoidális vérzés (SAH) a vér extravazációjából áll az arachnoid és a pia mater közötti térbe. A vérzés a legtöbb esetben az agyi aneurizma szakadásának következménye. Különösen az 55 éves átlagéletkorú nőket érinti. Annak ellenére, hogy évente 1000 emberből csak 9 eset fordul elő, a fiatal kor, valamint a magas mortalitás és morbiditás több év egészséges életének elvesztéséhez vezet. Valójában azok a betegek, akik túlélték az agyi aneurizmarepedést, kognitív hiányosságoktól, viselkedési zavaroktól szenvednek, és nem tudnak visszatérni korábbi termelékenységi szintjükhöz és munkahelyükhöz. A terápiás prioritások a következők: az újravérzés megelőzése, endovaszkuláris kezeléssel (ha lehetséges) vagy idegsebészeti aneurizma nyírással; a vér subarachnoidális ütemébe történő extravazációjával kapcsolatos szövődmények megelőzése, mint például az akut hydrocephalus kezelés (amely a betegek 20%-ában fordul elő), kamrai külső drenázs pozicionálással, és késleltetett agyi ischaemia, főként vasospasmus miatt, nimodipin endovénás beadásával; optimális perfúziós nyomás fenntartása. Kórélettani szempontból az aneurizma ruptura okozta korai mechanikai károsodást (a vérzéstömeg-hatásból eredő szövetpusztulás, akut hydrocephalus, herniatio vagy esetleges intraparenchymalis haematoma következtében) a vérzést követő három-tizennégy nappal szubakut károsodás alakulhat ki. , a késleltetett agyi ischaemia miatt. Ennek fő oka a vasospasmus, amely az SAH 20-30%-át bonyolítja, a mikrokeringés zavara és a mikrotromboembolia. A másodlagos károsodás patogenezise nem tisztázott, de kimutatták, hogy a gyulladás és az endoteliális apoptózis szerepet játszik a vasospasmus kialakulásában. Ezenkívül egyes tanulmányok azt mutatják, hogy az akut neurológiai diszfunkcióban szenvedő betegeknél nagyobb a szervi elégtelenség kockázata, különösen a tüdő és a vese esetében.

Az oszteopontin (OPN) egy szekretált extracelluláris mátrix glikoprotein, amely számos fiziológiai és kóros folyamatban játszik szerepet, mint például a szöveti átalakulásban, a fibrózisban, a sejtvándorlásban, az apoptózis gátlásában és a gyulladásban. Úgy gondolják, hogy az endogén OPN védelmet nyújt az ischaemiás károsodással szemben mind az agyban, mind más szervekben, beleértve a vesét is. Emellett a rekombináns OPN beadása antiapoptotikus hatás révén jelentősen csökkenti az ischaemiás területet fokális agyi ischaemia modellben. A SAH állatmodelljein végzett közelmúltbeli in vivo vizsgálatok kimutatták, hogy az OPN fontos szerepet játszik; beadása mérsékli az agykárosodást, csökkenti a metalloproteináz 9-et és gátolja az indukálható nitrogén-monoxid-szintázt. Úgy tűnik, hogy az OPN-kezelés megakadályozza az érgörcsöt is, endogén mitogén-aktivált fehérje (MAP) inhibitort indukál, pl. MAP kináz foszfatáz 1, és csökkenti a simaizomsejtek és az endotélsejtek apoptózisát. Ezen a területen egy további kutatási terület a mikrorészecskék, azaz a vérlemezkék, leukociták, eritrociták és endothelsejtek által kibocsátott mediátorok. Ellentétben azzal, amit korábban gondoltak, ezek nem az apoptotikus koagulációs sejtekből származó hulladékanyag egy formáját képviselik, és a legújabb tanulmányok kimutatták parakrin ad szabályozó aktivitásukat. Ischaemiás stroke esetén az endothel mikrorészecskék szintje közvetlenül függ a klinikai súlyosságtól és az ischaemiás terület kiterjedésétől. Tipikus parenchymás vérzés esetén a mikrorészecskék szintje magasabb mind a vérben, mind a folyadékban, és rosszabb klinikai eredménnyel jár. SAH-ban megnövekedett mikrorészecskék szinteket mutattak ki, különösen a vérzés napján, és a mikrorészecskék szintje típusonként változik. Másrészt a fluktuációkban szerepet játszó típusokról és azok időbeli lefutásáról szóló cikkek adatai nem egyeznek: Lackner et al. 20 SAH-beteget (Fisher II, III és IV) értékeltek ki a vérzést követő első tizenöt napban, és magasabb vérlemezke-, endothel-, eritrocita- és leukocita-mikrorészecskék-szintet találtak az egészséges kontrollokhoz képest [28]. Ezen túlmenően, az endothel típusú differenciálódási klaszter (CD) 105 és CD 62 markerek esetében különösen megemelkedett az érgörcsben szenvedő betegeknél, dopplerrel dokumentálva. A vazospasmushoz kapcsolódó ischaemia szintén különösen magas vérlemezke CD 41 pozitív mikrorészecskéket mutat. Az elbocsátáskori rokkantsági fokozat ellenére a mikrorészecskék szintje magasabb a teljesen felépült betegekhez képest (n=11). Újabban Sanborn et al. 22 SAH-betegen végzett vizsgálat, akiknél nagymértékben terjed a vér (Fisher III és IV), megerősíti a mikrorészecskék emelkedett szintjét ezeknél a betegeknél. Az endothel és a thrombocyta mikrorészecskék szintjének emelkedése is igazolt, míg a vasospasmusra utaló jelekkel nem találtak összefüggést egyik ultrahangban sem (az elülső keringésben 125 cm/s-nál nagyobb, hátsó keringésben 100 cm/s-nál nagyobb átlagsebesség mellett, a Lindegaard-arány nagyobb, mint 3) és angiográfia.

A publikált adatok nem egyöntetűek a vasospasmus és az ischaemia CT-vizsgálata és a fogyatékosság közötti összefüggést illetően.

A vizsgálat elsődleges végpontja a következők értékelése:

1) az OPN és a mikrorészecskék szintje és a vasospasmus kialakulása/ischaemiás léziója közötti összefüggés a CT-vizsgálat során, majd a betegek közép- és hosszú távú kimenetelével.

A másodlagos végpontok a következők voltak:

1. Az OPN mennyiségének változása SAH-ban szenvedő betegek italában és vérében a vérzés és a vérzés utáni napokon, azaz az 1., 2., 3., 5., 7., 9., 11. napon.
2. Mikrorészecskék szintjei ivóvízben és vérben szenvedő SAH-ban szenvedő betegeknél a vérzés napján és a vérzés utáni, azaz az 1., 2., 3., 5., 7., 9., 11. napon, hogy értékeljük mind a vasospasmusra vonatkozó prediktív értéküket, mind pedig a korrelációt a vese- ill. a tüdőfunkció romlása és 3-6 hónapos kimenetel.
3. Izolált mikrorészecskéket használnak a vese- és tüdő endothelsejtek in vitro aktiválására, egy lehetséges keresztbeszéd kiemelésére, az endothel károsodás markereinek elemzésére.

A toborzás időtartama egy év lesz. A kórházba való belépéskor CT-vizsgálatot végeznek, valamint Fischer-pontszámot, Hunt- és Hess-pontszámot, valamint a Neurológiai Sebészek Világszövetsége (WFNS) pontszámát. Regisztráljuk a demográfiai változókat, azaz az életkort, a nemet, a tünetek megjelenését és a társbetegségeket.

Az angiográfiát vagy az angio-CT-vizsgálatot a legjobb klinikai gyakorlatnak megfelelően végzik a nyílt aneurizma jelenlétének, méretének és jellemzőinek dokumentálására. Az SAH-betegek kezelése rutinszerű klinikai bevált gyakorlatként történik. A betegeket az I. naptól kezdődően koponyán keresztüli dopplerrel monitorozzák, majd klinikailag minden nap. Ha nem következik be klinikai változás, a betegeket CT-perfúziós angiográfiának vagy angiográfiának vetik alá a 7. napon (+/- 1 nap). Ha a klinikai állapot romlik vagy a doppler-sebesség növekszik (az érgörcsöt enyhének tekintve, ha az agyi artérián belüli átlagsebesség 120-150 cm/s, közepesen 150-200 cm/s és súlyos>200 cm/s) angiográfiát és endovaszkuláris nimodipin vizsgálatát kell mérlegelni. a standard protokoll terápiához. Az angiográfiás érgörcs az agyi artériák beszűküléséből áll, amelyet neuroradiológus igazolt. Klinikai érgörcsnek minősül a tudat romlása (Glasgow-i kóma skála (GCS) 2 pontos csökkenés) és/vagy új gócdeficit megjelenése, miután az egyéb okokat kizárták, mint például roham, újravérzés, láz. A 3. naptól kezdve minden új ischaemia CT-jelet regisztrálnak.

A 3-6 hónapos eredményeket a GOS-E (Extended Glasgow Coma Scale; 8 pontos skála, a haláltól a felső jó felépülésig, SAH-hoz kapcsolódó fogyatékosság nélkül) értékeli. Ennek az információnak a megszerzéséhez a képzett személyzet magával vagy egy közeli hozzátartozójával interjút készít.

Biológiai mintákat vesznek a felvételkor, azaz a vérzést követő 24 órán belül, valamint az 1., 2., 3., 5., 7., 9., 11. napon. A steril folyadékot a zsákból távolabbról a gyűjtőkamrába veszik 10 ml/darab mennyiségben, minden nap ugyanabban az időkeretben. Egyszerre (körülbelül 7:00-kor) 3 ml vért és vizeletet veszünk. A liquort, a plazmát és a vizeletet centrifugáljuk (2500 ford./perc 30 percig), a felülúszókat aliquot részekre osztjuk és -80 °C hőmérsékleten lefagyasztjuk az elemzésig. Az OPN analízist a kereskedelemben kapható enzimhez kötött immunszorbens vizsgálati (ELISA) kittel végezzük, a gyártó javaslatát követve (AssayDesigns Inc., Michigan; Pierce Biotechnology Inc., Rockford, IL). A gyulladásos válasz jobb leírása érdekében a fő T helper 1 (Th)1 és Th2 citokineket, valamint az agykárosodás markereit (enoláz neuron specifikus (NSE), aszimmetrikus dimetilarginin (ADMA) stb.) mérjük. A vizeleten számszerűsítik a korai preklinikai károsodás markereit. A mikrorészecskék izolálása és jellemzése Nanosight-val történik méret és koncentráció alapján, míg a fő felületi antigének azonosítása citofluorimetriával történik, meghatározva a származást: leukocita, eritrocita, vérlemezke, endoteliális sejtek. Az in vitro analízist vese- és pulmonalis endotélsejtek egyrétegű sejtjein végezzük. Naponta ellenőrizni fogják a vízháztartást, a kreatinint, a leukociták számát, a fertőzést/kolonizációt, a nefrotoxikus gyógyszereket.

A mikrorészecskék hatását in vitro értékeljük köldökzsinór endothel sejteken (HUVEC), simaizomsejteken (SMC), tüdő és vese endothel sejtjein, a betegek plazmából származó tisztított mikrorészecskéivel és anélkül inkubálva. Ezen túlmenően, elemzést végeznek a következők értékelésére: apoptózis (Tunel festés), angiogenezis (kapillárisszerű struktúrák bizonyítéka a Matrigen lemezen), leukocita adhézió és adhéziós molekula expressziója.

Mivel az irodalomban nem találhatók adatok az OPN szintjéről az SAH során, és a mikrorészecskékre vonatkozó adatok sem egyöntetűek, valós mintaméretet nem számítottunk ki. Tekintettel arra, hogy a betegek 20-30%-a várhatóan szövődményes volt érgörcsösséggel, egy év alatt 60 beteg bevonásával terveztük 12-18 érgörcsös beteget. Azok a résztvevők, akik megfelelnek a felvételi és kizárási kritériumoknak, egy éven belül bekerülnek a Novara Ospedale Maggiore della Carità intenzív osztályára és idegsebészeti osztályára (pl. 2018. január 31., 2019. január 30.). A tavalyi felvételek alapján intenzív osztályon 20, idegsebészeti osztályon 40 beteget várnak. T0-nál a mikrorészecskék szintjét Wilcoxon rangteszttel elemezzük érgörcsben szenvedő és nem szenvedő betegeknél. Az általánosított gőzegyenletekkel a mikrorészecskék szintjeit összehasonlítják a vasospasmusban szenvedő és nem szenvedő betegek, illetve új ischaemiás események között. A 3 és 6 hónapos GOS-E-t Kruskal-Wallis teszttel hasonlítjuk össze. A mikrorészecskék száma, valamint a vasospasmus és ischaemia előfordulása közötti összefüggést Spearman korrelációval határozzuk meg. A 0,05-nél kisebb p érték lesz a statisztikai szignifikancia küszöbértéke. Az elemzés a STATA segítségével történik. Ami az in vitro kísérleteket illeti, nem paraméteres teszteket kell végezni.