Hodnocení úrovně a prognostické relevance nových markerů neurozánětu u subarachnoidálního krvácení (ESA-MICROPN)

Subarachnoidální krvácení (SAH) spočívá v extravazaci krve do prostoru mezi arachnoidální a pia mater. Krvácení je ve většině případů důsledkem ruptury mozkového aneuryzmatu. Postihuje zejména ženy s průměrným věkem 55 let. Přestože je incidence pouze 9 případů z 1000 lidí ročně, nízký věk a vysoká mortalita a nemocnost vedou ke ztrátě několika let zdravého života. Ve skutečnosti pacienti, kteří přežili rupturu mozkového aneuryzmatu, trpí kognitivními deficity, poruchami chování a nejsou schopni se vrátit na svou dřívější úroveň produktivity a zaměstnání. Priority terapie jsou: prevence opětovného krvácení s endovaskulární léčbou (pokud je to možné) nebo neurochirurgickým odříznutím aneurismu; prevence komplikací spojených s extravazací krve do subarachnoidálního tempa, jako je léčba akutního hydrocefalu (která se vyskytuje u 20 % pacientů), umístěním ventrikulární zevní drenáže a opožděná cerebrální ischemie, zejména kvůli vazospasmu, endovenózním podáváním nimodipinu; udržování optimálního perfuzního tlaku. Z patofyziologického hlediska může po časném mechanickém poškození, způsobeném rupturou aneuryzmatu (v důsledku destrukce tkáně v důsledku hemoragického masového efektu, akutního hydrocefalu, herniace nebo možného intraparenchymálního hematomu) dojít k subakutnímu poškození od tří do čtrnácti dnů po krvácení kvůli opožděné mozkové ischemii. Hlavní příčinou této události jsou vazospazmus, který komplikuje 20-30 % SAH, mikrocirkulační dysfunkce a mikrotromboembolismus. Patogeneze sekundárního poškození není jasná, ale ukázalo se, že zánět a apoptóza endotelu se podílejí na rozvoji vazospasmů. Některé studie navíc ukazují, že pacienti s akutní neurologickou dysfunkcí mají větší riziko selhání orgánů, zejména plic a ledvin.

Osteopontin (OPN) je secernovaný glykoprotein extracelulární matrix, který hraje několik rolí ve fyziologických a patologických procesech, jako je remodelace tkáně, fibróza, buněčná migrace, inhibice apoptózy a zánět. Předpokládá se, že endogenní OPN plní ochrannou aktivitu proti ischemickému poškození jak v mozku, tak v jiných orgánech, včetně ledvin. Kromě toho podávání rekombinantního OPN výrazně snižuje ischemickou oblast u modelu fokální cerebrální ischemie antiapoptickým účinkem. Nedávné studie in vivo na zvířecích modelech SAH ukázaly, že OPN hraje hlavní roli; jeho podávání zmírňuje poškození mozku, snižuje metaloproteinázu 9 a inhibuje indukovatelnou syntázu oxidu dusnatého. Zdá se, že léčba OPN také zabraňuje vazospasmu, indukuje endogenní inhibitor mitogenem aktivovaného proteinu (MAP), tj. MAP kináza fosfatáza 1 a snížení apoptózy buněk hladkého svalstva a endoteliálních buněk. Další výzkumnou oblastí v této oblasti jsou mikročástice, tedy mediátory uvolňované krevními destičkami, leukocyty, erytrocyty a endoteliálními buňkami. Na rozdíl od toho, co se dříve myslelo, nepředstavují formu odpadního materiálu z apoptotických koagulačních buněk a nedávné studie ukazují jejich parakrinní a regulační aktivitu. U ischemické cévní mozkové příhody hladiny endoteliálních mikročástic přímo souvisí s klinickou závažností a rozšířením ischemické oblasti. Při typickém parenchymálním krvácení jsou hladiny mikročástic vyšší jak v krvi, tak v likéru a jsou spojeny s horšími klinickými výsledky. U SAH byly prokázány zvýšené hladiny mikročástic, zejména v den krvácení, a hladiny mikročástic se mění podle typu. Na druhou stranu se mezi články neshodují data o typech podílejících se na fluktuacích a jejich časovém průběhu: Lackner et al. hodnotili 20 pacientů s SAH (Fisher II, III a IV) v prvních patnácti dnech od krvácení a zjistili vyšší krevní hladiny destičkových, endoteliálních, erytrocytárních a leukocytárních mikročástic ve srovnání se zdravými kontrolami [28]. Navíc endoteliální typ pozitivní na markery clusteru diferenciace (CD) 105 a CD 62 byl zvláště zvýšen u pacientů postižených vazospasmem, dokumentovaným dopplerem. Ischemie spojená s vazospasmem také představuje zvláště vysoké hladiny destiček CD 41 pozitivních mikročástic. Bez ohledu na stupeň postižení v době propuštění jsou hladiny mikročástic vyšší ve srovnání s plně uzdravenými pacienty (n=11). Nedávno Sanborn et al. studie na 22 pacientech s SAH s masivním šířením krve (Fisher III a IV) potvrzuje hladiny elevace mikročástic u těchto pacientů. Je také ověřeno zvýšení hladin endoteliálních a trombocytárních mikročástic, přičemž nebyla nalezena žádná korelace s průkazem vazospasmu, a to jak v ultrazvuku (průměrná rychlost vyšší než 125 cm/s v přední cirkulaci nebo vyšší než 100 cm/s v zadní cirkulaci, kromě Lindegaardův poměr vyšší než 3) a angiografie.

Publikovaná data nejsou jednotná ani ve vztahu mezi vazospasmem a průkazem ischemie na CT skenu, ani s postižením.

Primárním cílem studie je vyhodnotit:

1) korelace mezi OPN a hladinami mikročástic a rozvojem vazospasmu/ischemické léze při CT vyšetření a následně se střednědobým a dlouhodobým výsledkem pacientů.

Sekundární koncové body byly:

1. Změny množství OPN v tekutině a krvi pacientů s SAH v den krvácení a po hemoragii, tj. 1., 2., 3., 5., 7., 9., 11. den.
2. Hladiny mikročástic u pacientů s likérem a krví s SAH v den krvácení a po krvácení, tj. 1., 2., 3., 5., 7., 9., 11. den, aby bylo možné vyhodnotit jak jejich prediktivní hodnotu pro vazospasmus, tak korelaci s renálními resp. zhoršení funkce plic a výsledek 3-6 měsíců.
3. Izolované mikročástice budou použity k aktivaci in vitro renálních a plicních endoteliálních buněk za účelem zvýraznění možného cross talku, analýzy markerů poškození endotelu.

Délka náboru bude jeden rok. Při vstupu do nemocnice bude provedeno CT vyšetření a také Fischerovo skóre, Huntovo a Hessovo skóre a skóre Světové federace neurologických chirurgů (WFNS). Budeme registrovat demografické proměnné, tj. věk, pohlaví, příznaky na začátku a komorbiditu.

Angiografie nebo angio-CT sken budou provedeny v souladu s nejlepší klinickou praxí, aby se zdokumentovala přítomnost, rozměry a charakteristiky otevřeného aneuryzmatu. Léčba pacientů se SAH bude prováděna jako rutinní klinická nejlepší praxe. Pacienti budou sledováni transkraniálním dopplerem počínaje dnem I a klinicky každý den. Pokud nedojde k žádné klinické změně, budou pacienti podrobeni CT perfuzní angiografii nebo angiografii v den 7 (+/- 1 den). Pokud se klinický stav zhorší nebo se dopplerovská rychlost zvýší (vazospasmus se považuje za mírný, když střední rychlost uvnitř mozkové tepny 120–150 cm/s, střední 150–200 cm/sa těžký >200 cm/s), bude zvážena angiografie a endovaskulární nimodipin, podle ke standardní protokolární terapii. Angiografický vazospasmus spočívá v zúžení mozkových tepen potvrzeném neuroradiologem. Klinický vazospasmus je definován jako zhoršení vědomí (Glasgow coma scale (GCS) snížení o 2 body) a/nebo nový fokální deficit po vyloučení jiných příčin, jako jsou záchvaty, opětovné krvácení, horečka. Každý nový CT důkaz ischemie bude registrován od 3. dne.

Po 3-6 měsících bude výsledek vyhodnocen pomocí GOS-E (Extended Glasgow Coma Scale; 8bodová škála, od smrti k hornímu dobrému zotavení, bez jakéhokoli postižení souvisejícího s SAH). K získání těchto informací provede vyškolený personál rozhovory buď s pacienty samotnými, nebo s jejich blízkým příbuzným.

Biologické vzorky budou odebrány při příjmu, tedy do 24 hodin od krvácení, a ve dnech 1, 2, 3, 5, 7, 9, 11. Sterilní louh bude odebírán z vaku distálně k odběrové komoře v množství 10 ml/kus, každý den ve stejnou dobu. Současně bude odebrána krev v množství 3 ml/kost a moč (cca v 7:00). Kapalina, plazma a moč budou centrifugovány (2500 ot./min po dobu 30 minut) a supernatanty budou rozděleny na alikvoty a zmrazeny při teplotě -80 °C až do analýzy. Analýza OPN bude provedena pomocí komerční soupravy ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) podle doporučení výrobce (AssayDesigns Inc., Michigan; Pierce Biotechnology Inc., Rockford, IL). Pro lepší popis zánětlivé reakce budou měřeny hlavní cytokiny T helper 1 (Th)1 a Th2 a také markery poškození mozku (specifické pro enolázový neuron (NSE), asymetrický dimethylarginin (ADMA) atd.). V moči budou kvantifikovány markery časného preklinického poškození. Izolace a charakterizace mikročástic bude provedena pomocí Nanosight na základě rozměru a koncentrace, zatímco hlavní povrchové antigeny budou identifikovány pomocí cytofluorimetrie s upřesněním provenience: leukocyty, erytrocyty, krevní destičky, endoteliální buňky. In vitro analýza bude provedena na monovrstvě renálních a plicních endoteliálních buněk. Denně bude sledována vodní bilance, kreatinin, počet leukocytů, infekce/kolonizace, nefrotoxické léky.

Účinek mikročástic bude hodnocen in vitro na endoteliálních buňkách pupečníku (HUVEC), na buňkách hladkého svalstva (SMC), na plicních a renálních endoteliálních buňkách, inkubovaných s purifikovanými mikročásticemi získanými z plazmy pacientů a bez nich. Kromě toho bude provedena analýza pro hodnocení: apoptózy (barvení Tunel), angiogeneze (důkaz kapilárních struktur na destičce Matrigen), adheze leukocytů a exprese adhezních molekul.

Protože v literatuře nejsou k dispozici žádné údaje o hladinách OPN během SAH a údaje o mikročásticích nejsou jednomyslné, skutečná velikost vzorku nebyla vypočtena. Vzhledem k tomu, že u 20–30 % pacientů se očekávalo, že bude mít vazospazmus, bylo naplánováno zařazení 60 pacientů během jednoho roku, aby bylo získáno 12–18 pacientů s vazospasmem. Účastníci splňující kritéria pro zařazení a vyloučení budou zapsáni jak na JIP, tak na neurochirurgické oddělení Novara Ospedale Maggiore della Carità v období jednoho roku (tj. 31. ledna 2018, 30. ledna 2019). Na základě loňských přijetí se očekává 20 pacientů na JIP a 40 pacientů na neurochirurgickém oddělení. V T0 budou hladiny mikročástic analyzovány u pacientů s vazospasmem a bez něj pomocí Wilcoxon rank testu. Pomocí zobecněných parních rovnic budou porovnány hladiny mikročástic mezi pacienty s a bez vazospazmu nebo nových ischemických příhod. 3 a 6 měsíční GOS-E bude porovnán pomocí Kruskal-Wallisova testu. Vztah mezi počtem mikročástic a vazospasmem a výskytem ischemie bude definován Spearmanovou korelací. Hodnota p menší než 0,05 bude prahem statistické významnosti. Analýza bude provedena pomocí STATA. Pokud jde o experimenty in vitro, budou provedeny neparametrické testy.