Evaluering av nivået og prognostisk relevans av nye nevroinflammasjonsmarkører ved subaraknoidalblødning (ESA-MICROPN)

Subaraknoidalblødning (SAH) består av ekstravasering av blod inn i rommet mellom arachnoid og pia mater. Blødning er en konsekvens av cerebral aneurismeruptur i de fleste tilfeller. Det rammer spesielt kvinner med en gjennomsnittsalder på 55 år. Til tross for at forekomsten kun er 9 tilfeller av 1000 personer per år, fører ung alder og høy dødelighet og sykelighet til å miste flere år med sunt liv. Faktisk lider pasienter som overlevde cerebral aneurismeruptur av kognitive mangler, atferdsforstyrrelser og er ikke i stand til å komme tilbake til sitt tidligere produktivitetsnivå og jobb. Terapiprioriteter er: å forhindre reblødning, med endovaskulær behandling (når mulig) eller nevrokirurgisk aneurismeklipping; forebygging av komplikasjoner assosiert med ekstravasering av blod til subaraknoidal tempo, slik som akutt hydrocephalusbehandling (som forekommer hos 20 % av pasientene), ved ventrikulær ekstern dreneringsposisjonering og forsinket cerebral iskemi, hovedsakelig på grunn av vasospasme, ved endovenøs administrering av nimodipin; optimalt vedlikehold av perfusjonstrykket. Fra et patofysiologisk synspunkt, etter tidlig mekanisk skade, forårsaket av aneurismeruptur (på grunn av vevsdestruksjon som følge av blødningsmasseeffekt, akutt hydrocephalus, herniering eller et mulig intraparenkymalt hematom) kan en subakutt skade utvikles fra tre til fjorten dager etter blødning , på grunn av forsinket cerebral iskemi. Hovedansvarlig for denne hendelsen er vasospasmer, som kompliserer 20-30 % av SAH, mikrosirkulasjonsdysfunksjon og mikrotromboemboli. Sekundær skadepatogenese er ikke klar, men inflammasjon og endotelial apoptose er vist å være involvert i vasospasmeutvikling. Dessuten viser noen studier at pasienter med akutt nevrologisk dysfunksjon har en større risiko for organsvikt, spesielt for lunger og nyrer.

Osteopontin (OPN) er et utskilt ekstracellulært matriksglykoprotein som spiller flere roller i fysiologiske og patologiske prosesser, som vevsremodellering, fibrose, cellulær migrasjon, apoptoseinhibering og betennelse. Endogen OPN antas å oppfylle en beskyttende aktivitet over iskemisk skade både i hjernen og andre organer, inkludert nyre. Dessuten reduserer rekombinant OPN-administrasjon markant iskemisk område i en fokal cerebral iskemimodell, ved en antiapoptotisk virkning. Nylige in vivo-studier på dyremodeller av SAH viste at OPN spiller en stor rolle; administrasjonen demper cerebral skade som reduserer metalloproteinase 9 og hemmer induserbar nitrogenoksidsyntase. Behandling med OPN ser ut til å forhindre vasospasme også, og induserer en endogen mitogenaktivert protein (MAP)-hemmer, dvs. MAP kinase fosfatase 1, og redusere glatte muskelceller og endotelceller apoptose. Et ytterligere forskningsfelt på dette området gjelder mikropartikler, det vil si mediatorer som frigjøres av blodplater, leukocytter, erytrocytter og endotelceller. I motsetning til hva man pleide å tro, representerer de ikke en form for avfallsmateriale fra apoptotiske koagulasjonsceller, og nyere studier viser deres parakrine ad regulatoriske aktivitet. I iskemisk slag er nivåene av endotelmikropartikler direkte relatert til klinisk alvorlighetsgrad og iskemisk områdeforlengelse. Ved typiske parenkymale blødninger er nivåene av mikropartikler høyere både i blod og i brennevin og assosiert med dårligere klinisk utfall. I SAH er det påvist økte nivåer av mikropartikler, spesielt på blødningsdagen, og nivåer av mikropartikler endres avhengig av type. På den annen side er data uenige blant artikler om typer involvert i fluktuasjoner og deres tidsforløp: Lackner et al. evaluerte 20 SAH-pasienter (Fisher II, III og IV) i løpet av de første femten dagene etter blødning og fant høyere blodnivåer av blodplate-, endotel-, erytrocytt- og leukocyttmikropartikler sammenlignet med friske kontroller [28]. Dessuten var endoteltype positiv for cluster of differentiation (CD) 105 og CD 62 markører spesielt økt hos pasienter påvirket av vasospasme, dokumentert med doppler. Vasospasme assosiert iskemi, presenterer også spesielt høye nivåer av blodplate CD 41 positive mikropartikler. Til tross for funksjonshemming ved utskrivningstidspunktet, er nivåene av mikropartikler høyere sammenlignet med fullstendig restituerte pasienter (n=11). Mer nylig har Sanborn et al. studie på 22 SAH-pasienter med massiv blodspredning (Fisher III og IV) bekrefter forhøyede mikropartikler hos disse pasientene. Forhøyelse av nivåer av endotel- og blodplatemikropartikler er også verifisert, mens ingen korrelasjon er funnet med tegn på vasospasme, både ved ultralyd (gjennomsnittlig hastighet høyere enn 125 cm/s i fremre sirkulasjon eller høyere enn 100 cm/s i bakre sirkulasjon, i tillegg til et Lindegaard-forhold høyere enn 3) og angiografi.

Publiserte data er ikke enstemmige om verken korrelasjonen mellom vasospasme og CT-skanningsbevis på iskemi eller med funksjonshemming.

Det primære endepunktet for studien er å evaluere:

1) korrelasjonen mellom OPN- og mikropartikkelnivåer og vasospasmeutvikling/iskemisk lesjon ved CT-skanning, og deretter med pasientutfall på middels og lang sikt.

Sekundære endepunkter var:

1. Endringer av OPN-mengde i brennevin og blod hos pasienter med SAH på dagen for blødning og etter blødning, dvs. dag 1, 2, 3, 5, 7, 9, 11.
2. Mikropartikkelnivåer hos brennevin- og blodpasienter med SAH på blødningsdagen og etter blødning, dvs. dag 1, 2, 3, 5, 7, 9, 11, for å evaluere både deres prediktive verdi for vasospasme og korrelasjonen med nyre- eller lungefunksjon forverret og 3-6 måneders utfall.
3. Isolerte mikropartikler vil bli brukt til å aktivere in vitro nyre- og lungeendotelceller med det formål å fremheve en mulig krysstale, analysere markører for endotelskade.

Rekrutteringens varighet vil være ett år. Ved sykehusinnleggelse vil en CT-skanning bli utført i tillegg til Fischer-score, Hunt and Hess-score og World Federation of Neurological Surgeons (WFNS)-score. Vi vil registrere demografiske variabler, dvs. alder, kjønn, symptomer ved debut og komorbiditet.

Angiografi eller angio-CT-skanning vil bli utført i henhold til beste kliniske praksis for å dokumentere tilstedeværelse, dimensjon og karakteristika ved patentaneurisme. SAH-pasienters behandling vil bli utført som rutinemessig klinisk beste praksis. Pasienter vil bli overvåket med transkraniell doppler fra dag I og klinisk hver dag. Hvis ingen klinisk endring vil skje, vil pasientene bli underkastet en CT-perfusjonangiografi eller angiografi på dag 7 (+/- 1 dag). Hvis den kliniske tilstanden forverres eller dopplerhastigheten øker (vurderer vasospasme som mild når gjennomsnittshastigheten inne i cerebral arterie er 120-150 cm/s, moderat 150-200 cm/s og alvorlig >200 cm/s), vil angiografi og endovaskulært nimodipin bli vurdert, iht. til standard protokollbehandling. Angiografisk vasospasme består i innsnevring av cerebrale arterier bekreftet av nevroradiolog. Klinisk vasospasme er definert som bevissthetsforverring (Glasgow komaskala (GCS) 2 poeng reduksjon) og/eller et nytt fokalt underskudd, etter at andre årsaker er utelukket, som anfall, reblødninger, feber. Alle nye CT-bevis på iskemi vil bli registrert fra dag 3.

Etter 3-6 måneder vil utfallet bli evaluert av GOS-E (Extended Glasgow Coma Scale; 8 poengskala, fra død til øvre god bedring, uten noen funksjonshemming knyttet til SAH). For å få denne informasjonen vil opplært personale intervjue enten pasienter selv eller en nær slektning.

Biologiske prøver vil bli tatt ved innleggelse, dvs. innen 24 timer etter blødningen, og i dag 1, 2, 3, 5, 7, 9, 11. Steril brennevin vil bli tatt fra posen distalt til oppsamlingskammeret, i en mengde på 10 ml/dyse, på samme tidsramme hver dag. Blod i en mengde på 3 ml/die og urin vil bli samlet inn samtidig (ca. kl. 07.00). Brennevin, plasma og urin vil bli sentrifugert (2500 rpm i 30 minutter) og supernatanter vil bli alikvotert og frosset ved en temperatur på -80°C frem til analyse. OPN-analyse vil bli utført med kommersielt enzym-koblet immunosorbent assay (ELISA) kit, etter forslag fra produsenten (AssayDesigns Inc., Michigan; Pierce Biotechnology Inc., Rockford, IL). For bedre å beskrive inflammatorisk respons, vil hoved-T-hjelper 1 (Th)1 og Th2 cytokiner bli målt samt cerebrale skademarkører (enolase-nevronspesifikk (NSE), asymmetrisk dimetylarginin (ADMA) etc.). På urin vil markører for tidlig preklinisk svikt kvantifiseres. Isolering og karakterisering av mikropartikler vil bli utført med Nanosight basert på dimensjon og konsentrasjon, mens hovedoverflateantigener vil bli identifisert i cytofluorimetri, som spesifiserer proveniens: leukocytt, erytrocytt, blodplate, endotelceller. In vitro analyse vil bli utført på nyre- og lungeendotelceller monolag. Vannbalanse, kreatinin, antall leukocytter, infeksjon/kolonisering, nefrotoksiske medikamenter vil bli overvåket daglig.

Mikropartiklers effekt vil bli evaluert in vitro på navlestrengsendotelceller (HUVEC), på glatte muskelceller (SMC), på lunge- og nyreendotelceller, inkubert med og uten pasientens plasmaavledede rensede mikropartikler. I tillegg vil det bli utført analyser for å evaluere: apoptose (tunelfarging), angiogenese (bevis på kapillærlignende strukturer på Matrigen-plate), leukocyttadhesjon og adhesjonsmolekylekspresjon.

Siden det ikke finnes data i litteraturen om OPN-nivåer under SAH og data om mikropartikler ikke er enstemmige, ble en reell prøvestørrelse ikke beregnet. Tatt i betraktning at 20%-30% av pasientene var forventet å være kompliserte med vasospasme, ble innrulleringen planlagt med 60 pasienter i løpet av ett år for å få 12-18 pasienter med vasospasme. Deltakere som samsvarer med inkluderings- og eksklusjonskriterier vil bli registrert både på intensivavdelingen og nevrokirurgisk avdeling på Novara Ospedale Maggiore della Carità i løpet av ett år (dvs. 31. januar 2018, 30. januar 2019). Basert på innleggelser i fjor forventes det 20 pasienter på intensivavdeling og 40 pasienter på nevrokirurgisk avdeling. Ved T0 vil mikropartikkelnivåer bli analysert hos pasienter med og uten vasospasme med Wilcoxon rank test. Med generaliserte dampligninger vil nivåer av mikropartikler sammenlignes mellom pasienter med og uten vasospasme eller nye iskemiske hendelser. 3 og 6 måneder GOS-E vil bli sammenlignet med Kruskal-Wallis test. Forholdet mellom antall mikropartikler og vasospasme og iskemiforekomst vil bli definert med Spearman-korrelasjon. En verdi på p mindre enn 0,05 vil være terskelen for statistisk signifikans. Analyse vil bli utført med STATA. Når det gjelder in vitro-eksperimenter, vil ikke-parametriske tester bli utført.