Bewertung der Höhe und prognostischen Relevanz neuer Neuroinflammationsmarker bei Subarachnoidalblutung (ESA-MICROPN)

Eine Subarachnoidalblutung (SAB) besteht aus einer Blutextravasation in den Raum zwischen Arachnoidea und Pia mater. Blutungen sind in den meisten Fällen eine Folge der Ruptur eines zerebralen Aneurysmas. Betroffen sind vor allem Frauen mit einem Durchschnittsalter von 55 Jahren. Obwohl die Inzidenz nur 9 Fälle pro 1000 Personen pro Jahr beträgt, führen das junge Alter und die hohe Mortalität und Morbidität dazu, dass mehrere Jahre eines gesunden Lebens verloren gehen. Tatsächlich leiden Patienten, die die Ruptur eines zerebralen Aneurysmas überlebt haben, unter kognitiven Defiziten, Verhaltensstörungen und sind nicht in der Lage, zu ihrem früheren Produktivitätsniveau und Arbeitsplatz zurückzukehren. Therapieprioritäten sind: Verhinderung von Nachblutungen durch endovaskuläre Behandlung (wenn möglich) oder neurochirurgische Aneurysma-Clipping; Verhinderung von Komplikationen im Zusammenhang mit Blutextravasation in den Subarachnoidalschritt, wie z. B. akute Hydrozephalusbehandlung (die bei 20 % der Patienten auftritt), durch ventrikuläre externe Drainagepositionierung und verzögerte zerebrale Ischämie, hauptsächlich aufgrund von Vasospasmus, durch endovenöse Verabreichung von Nimodipin; optimale Aufrechterhaltung des Perfusionsdrucks. Aus pathophysiologischer Sicht kann nach einer frühen mechanischen Schädigung durch Aneurysmaruptur (aufgrund von Gewebezerstörung infolge von Blutungsmasseneffekt, akutem Hydrozephalus, Herniation oder einem möglichen intraparenchymalen Hämatom) drei bis vierzehn Tage nach der Blutung eine subakute Schädigung entstehen , wegen verzögerter zerebraler Ischämie. Hauptverantwortlich für dieses Ereignis sind Vasospasmen, die 20-30 % der SAH komplizieren, Mikrozirkulationsstörungen und Mikrothromboembolien. Die Pathogenese der sekundären Schädigung ist nicht klar, aber es wird gezeigt, dass Entzündung und endotheliale Apoptose an der Entwicklung von Vasospasmen beteiligt sind. Darüber hinaus zeigen einige Studien, dass Patienten mit akuter neurologischer Dysfunktion ein größeres Risiko für Organversagen haben, insbesondere für Lunge und Nieren.

Osteopontin (OPN) ist ein sezerniertes Glykoprotein der extrazellulären Matrix, das mehrere Rollen bei physiologischen und pathologischen Prozessen spielt, wie Gewebeumbau, Fibrose, Zellmigration, Apoptosehemmung und Entzündung. Es wird angenommen, dass endogenes OPN sowohl im Gehirn als auch in anderen Organen, einschließlich der Niere, eine Schutzwirkung gegenüber ischämischen Schäden ausübt. Außerdem verringert die rekombinante OPN-Verabreichung den ischämischen Bereich in einem fokalen zerebralen Ischämiemodell durch eine antiapoptotische Wirkung deutlich. Jüngste In-vivo-Studien an Tiermodellen von SAH haben gezeigt, dass OPN eine wichtige Rolle spielt; seine Verabreichung dämpft den zerebralen Schaden, verringert die Metalloproteinase 9 und hemmt die induzierbare Stickoxidsynthase. Die Behandlung mit OPN scheint auch Vasospasmus zu verhindern, indem sie einen endogenen Inhibitor des mitogenaktivierten Proteins (MAP) induziert, d.h. MAP-Kinase-Phosphatase 1 und reduziert die Apoptose glatter Muskelzellen und Endothelzellen. Ein weiteres Forschungsgebiet in diesem Bereich betrifft Mikropartikel, also Mediatoren, die von Blutplättchen, Leukozyten, Erythrozyten und Endothelzellen freigesetzt werden. Anders als früher angenommen, stellen sie keine Abfallstoffe apoptotischer Gerinnungszellen dar und neuere Studien zeigen ihre parakrine und regulatorische Aktivität. Bei einem ischämischen Schlaganfall beziehen sich die Endothel-Mikropartikelspiegel direkt auf den klinischen Schweregrad und die Ausdehnung des ischämischen Bereichs. Bei typischen Parenchymblutungen sind die Mikropartikelkonzentrationen sowohl im Blut als auch im Liquor höher und mit einem schlechteren klinischen Ergebnis verbunden. Bei SAH wurden erhöhte Mikropartikelkonzentrationen nachgewiesen, insbesondere am Tag der Blutung, und die Mikropartikelkonzentrationen ändern sich je nach Typ. Auf der anderen Seite stimmen die Daten über die an Schwankungen beteiligten Typen und deren zeitlichen Verlauf nicht überein: Lackner et al. untersuchten 20 SAH-Patienten (Fisher II, III und IV) in den ersten 15 Tagen nach der Blutung und fanden im Vergleich zu gesunden Kontrollen höhere Blutspiegel von Thrombozyten-, Endothel-, Erythrozyten- und Leukozyten-Mikropartikeln [28]. Darüber hinaus waren Endotheltyp-Positive für Differenzierungscluster (CD) 105- und CD 62-Marker besonders erhöht bei Patienten, die von Vasospasmus betroffen waren, was mit Doppler dokumentiert wurde. Vasospasmus-assoziierte Ischämie weisen auch besonders hohe Spiegel an Thrombozyten-CD 41-positiven Mikropartikeln auf. Ungeachtet des Behinderungsgrades zum Zeitpunkt der Entlassung sind die Mikropartikelwerte höher im Vergleich zu vollständig genesenen Patienten (n=11). Vor kurzem haben Sanborn et al. Studie an 22 SAH-Patienten mit massiver Blutausbreitung (Fisher III und IV) bestätigt die Mikropartikel-Erhöhung bei diesen Patienten. Eine Erhöhung der Spiegel von Endothel- und Blutplättchen-Mikropartikeln wird ebenfalls verifiziert, während keine Korrelation mit Anzeichen von Vasospasmus gefunden wird, sowohl im Ultraschall (mittlere Geschwindigkeit höher als 125 cm/s im vorderen Kreislauf oder höher als 100 cm/s im hinteren Kreislauf). ein Lindegaard-Verhältnis größer als 3) und Angiographie.

Die veröffentlichten Daten sind weder hinsichtlich der Korrelation zwischen Vasospasmus und CT-Scan-Beweis einer Ischämie noch hinsichtlich einer Behinderung einheitlich.

Der primäre Endpunkt der Studie ist die Bewertung von:

1) die Korrelation zwischen OPN- und Mikropartikelspiegeln und der Vasospasmusentwicklung/ischämischen Läsion beim CT-Scan und anschließend mit dem mittel- und langfristigen Patientenergebnis.

Sekundäre Endpunkte waren:

1. Änderungen der OPN-Menge in Liquor und Blut von Patienten mit SAB am Tag der Blutung und nach der Blutung, d. h. an den Tagen 1, 2, 3, 5, 7, 9, 11.
2. Mikropartikelspiegel bei Liquor- und Blutpatienten mit SAB am Tag der Blutung und nach der Blutung, d. h. an den Tagen 1, 2, 3, 5, 7, 9, 11, um sowohl ihren prädiktiven Wert für Vasospasmus als auch die Korrelation mit Nieren- oder Verschlechterung der Lungenfunktion und Ergebnis nach 3-6 Monaten.
3. Isolierte Mikropartikel werden verwendet, um Nieren- und Lungenendothelzellen in vitro zu aktivieren, um ein mögliches Übersprechen hervorzuheben und Endothelschadensmarker zu analysieren.

Die Rekrutierungsdauer beträgt ein Jahr. Beim Krankenhauseintritt wird ein CT-Scan sowie ein Fischer-Score, ein Hunt-and-Hess-Score und ein Score der World Federation of Neurological Surgeons (WFNS) durchgeführt. Wir registrieren demografische Variablen, d. h. Alter, Geschlecht, Symptome bei Beginn und Komorbidität.

Angiographie oder Angio-CT-Scan werden gemäß der besten klinischen Praxis durchgeführt, um das Vorhandensein, die Größe und die Merkmale des Patentaneurysmas zu dokumentieren. Die Behandlung von SAB-Patienten wird als routinemäßige klinische Best Practice durchgeführt. Die Patienten werden ab dem ersten Tag und jeden Tag klinisch mit transkraniellem Doppler überwacht. Wenn keine klinischen Veränderungen auftreten, werden die Patienten an Tag 7 (+/- 1 Tag) einer CT-Perfusionsangiographie oder Angiographie unterzogen. Wenn sich der klinische Zustand verschlechtert oder die Doppler-Geschwindigkeit zunimmt (Vasospasmus wird als mild angesehen, wenn die mittlere Geschwindigkeit in der Hirnarterie 120–150 cm/s beträgt, mäßig 150–200 cm/s und schwer >200 cm/s), werden Angiographie und endovaskuläres Nimodipin in Betracht gezogen zur Standardprotokolltherapie. Angiographischer Vasospasmus besteht in einer Verengung der Hirnarterien, die vom Neuroradiologen bestätigt wurde. Klinischer Vasospasmus ist definiert als Bewusstseinsverschlechterung (Glasgow-Coma-Skala (GCS) 2-Punkte-Reduktion) und/oder ein erneutes Auftreten eines fokalen Defizits, nachdem andere Ursachen ausgeschlossen wurden, wie Krampfanfälle, Nachblutungen, Fieber. Jeder neue CT-Beweis einer Ischämie wird ab Tag 3 registriert.

Nach 3-6 Monaten wird das Ergebnis durch GOS-E (erweiterte Glasgow-Koma-Skala; 8-Punkte-Skala, vom Tod bis zur Erholung des oberen guten Zustands, ohne verbleibende Behinderung im Zusammenhang mit SAH) bewertet. Um diese Informationen zu erhalten, wird geschultes Personal entweder den Patienten selbst oder einen nahen Angehörigen befragen.

Biologische Proben werden bei der Aufnahme entnommen, d. h. innerhalb von 24 Stunden nach der Blutung, und an den Tagen 1, 2, 3, 5, 7, 9, 11. Sterile Flüssigkeit wird aus dem Beutel distal zur Sammelkammer in einer Menge von 10 ml/Die jeden Tag zur gleichen Zeit entnommen. Zur gleichen Zeit (ca. 7:00 Uhr) werden Blut in einer Menge von 3 ml/Die und Urin gesammelt. Liquor, Plasma und Urin werden zentrifugiert (2500 U/min für 30 Minuten) und die Überstände werden aliquotiert und bis zur Analyse bei einer Temperatur von -80 °C eingefroren. Die OPN-Analyse wird mit einem handelsüblichen ELISA-Kit (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) gemäß Herstellervorschlag durchgeführt (AssayDesigns Inc., Michigan; Pierce Biotechnology Inc., Rockford, IL). Um die Entzündungsreaktion besser beschreiben zu können, werden die wichtigsten T-Helfer-1 (Th)1- und Th2-Zytokine sowie zerebrale Schädigungsmarker (Enolase-Neuronen-spezifisch (NSE), asymmetrisches Dimethylarginin (ADMA) etc.) gemessen. Im Urin werden Marker einer frühen präklinischen Beeinträchtigung quantifiziert. Die Isolierung und Charakterisierung von Mikropartikeln wird mit Nanosight basierend auf Größe und Konzentration durchgeführt, während die wichtigsten Oberflächenantigene in der Zytofluorimetrie identifiziert werden, wobei die Herkunft angegeben wird: Leukozyten, Erythrozyten, Blutplättchen, Endothelzellen. Die In-vitro-Analyse wird an monolayern Nieren- und Lungen-Endothelzellen durchgeführt. Wasserhaushalt, Kreatinin, Leukozytenzahl, Infektion/Kolonisation, nephrotoxische Medikamente werden täglich überwacht.

Die Wirkung von Mikropartikeln wird in vitro an Nabelschnur-Endothelzellen (HUVEC), an glatten Muskelzellen (SMC), an pulmonalen und renalen Endothelzellen bewertet, die mit und ohne gereinigte Mikropartikel aus Patientenplasma inkubiert werden. Darüber hinaus wird eine Analyse durchgeführt, um Folgendes zu bewerten: Apoptose (Tunel-Färbung), Angiogenese (Nachweis von kapillarähnlichen Strukturen auf der Matrigen-Platte), Leukozytenadhäsion und Expression von Adhäsionsmolekülen.

Da in der Literatur keine Daten zu OPN-Konzentrationen während SAH vorhanden sind und die Daten zu Mikropartikeln nicht einheitlich sind, wurde keine tatsächliche Stichprobengröße berechnet. In Anbetracht der Tatsache, dass bei 20 % bis 30 % der Patienten Komplikationen mit Vasospasmus erwartet wurden, war die Aufnahme von 60 Patienten in einem Jahr geplant, um 12 bis 18 Patienten mit Vasospasmus zu erhalten. Teilnehmer, die die Einschluss- und Ausschlusskriterien erfüllen, werden für einen Zeitraum von einem Jahr (d. h. 31. Januar 2018, 30. Januar 2019). Basierend auf den Zulassungen des letzten Jahres werden 20 Patienten auf der Intensivstation und 40 Patienten auf der Neurochirurgiestation erwartet. Bei T0 werden die Mikropartikelwerte bei Patienten mit und ohne Vasospasmus mit dem Wilcoxon-Rangtest analysiert. Mit verallgemeinerten Dampfgleichungen werden die Mikropartikelwerte zwischen Patienten mit und ohne Vasospasmus oder neuen ischämischen Ereignissen verglichen. 3 und 6 Monate GOS-E werden mit dem Kruskal-Wallis-Test verglichen. Die Beziehung zwischen der Anzahl der Mikropartikel und dem Auftreten von Vasospasmus und Ischämie wird mit der Spearman-Korrelation definiert. Ein Wert von p kleiner als 0,05 ist die Schwelle für statistische Signifikanz. Die Analyse wird mit STATA durchgeführt. Bei In-vitro-Experimenten werden nichtparametrische Tests durchgeführt.