Оценка уровня и прогностической значимости новых маркеров нейровоспаления при субарахноидальном кровоизлиянии (ESA-MICROPN)

Субарахноидальное кровоизлияние (САК) представляет собой экстравазацию крови в пространство между паутинной и мягкой мозговыми оболочками. Кровотечение в большинстве случаев является следствием разрыва аневризмы головного мозга. Это особенно затрагивает женщин со средним возрастом 55 лет. Несмотря на то, что заболеваемость составляет всего 9 случаев на 1000 человек в год, молодой возраст и высокая смертность и заболеваемость приводят к потере нескольких лет здоровой жизни. По сути, пациенты, пережившие разрыв аневризмы головного мозга, страдают когнитивным дефицитом, расстройствами поведения и не могут вернуться к прежнему уровню продуктивности и трудовой деятельности. Приоритеты терапии: профилактика повторного кровотечения, эндоваскулярное лечение (по возможности) или нейрохирургическое клипирование аневризмы; профилактика осложнений, связанных с экстравазацией крови в субарахноидальный ритм, таких как лечение острой гидроцефалии (встречается у 20% больных), установкой вентрикулярного наружного дренажа, отсроченной ишемии головного мозга, преимущественно за счет спазма сосудов, путем внутривенного введения нимодипина; поддержание оптимального перфузионного давления. С патофизиологической точки зрения после раннего механического повреждения, вызванного разрывом аневризмы (вследствие деструкции тканей в результате кровоизлияния, масс-эффекта, острой гидроцефалии, грыжи или возможной интрапаренхиматозной гематомы), в период от трех до четырнадцати дней после кровоизлияния может развиться подострое повреждение. , из-за отсроченной церебральной ишемии. Основной причиной этого явления являются спазм сосудов, осложняющий 20-30% САК, дисфункция микроциркуляции и микротромбоэмболия. Патогенез вторичного повреждения неясен, но показано, что в развитии вазоспазма участвуют воспаление и апоптоз эндотелия. Более того, некоторые исследования показывают, что у пациентов с острой неврологической дисфункцией повышен риск органной недостаточности, особенно легких и почек.

Остеопонтин (OPN) является секретируемым гликопротеином внеклеточного матрикса, который играет несколько ролей в физиологических и патологических процессах, таких как ремоделирование тканей, фиброз, клеточная миграция, ингибирование апоптоза и воспаление. Считается, что эндогенный ОПН выполняет защитную активность при ишемическом повреждении как головного мозга, так и других органов, включая почки. Кроме того, введение рекомбинантного ОПН заметно уменьшает площадь ишемии в модели фокальной церебральной ишемии за счет антиапоптотического действия. Недавние исследования in vivo на животных моделях SAH показали, что OPN играет важную роль; его введение ослабляет церебральное повреждение, уменьшая металлопротеиназу 9 и ингибируя индуцибельную синтазу оксида азота. Лечение ОПН, по-видимому, также предотвращает спазм сосудов, индуцируя эндогенный ингибитор митоген-активированного белка (МАР), т.е. МАР киназа фосфатаза 1 и снижение апоптоза клеток гладкой мускулатуры и эндотелиальных клеток. Дальнейшее направление исследований в этой области касается микрочастиц, то есть медиаторов, высвобождаемых тромбоцитами, лейкоцитами, эритроцитами и эндотелиальными клетками. Вопреки тому, что раньше считалось, они не представляют собой форму отходов из апоптотических коагуляционных клеток, и недавние исследования показывают их паракринную и регуляторную активность. При ишемическом инсульте уровни эндотелиальных микрочастиц напрямую связаны с клинической тяжестью и расширением зоны ишемии. При типичном паренхиматозном кровотечении уровни микрочастиц выше как в крови, так и в ликворе, что связано с худшим клиническим исходом. При САК было продемонстрировано повышение уровня микрочастиц, особенно в день кровотечения, и уровни микрочастиц меняются в зависимости от типа кровотечения. С другой стороны, данные в работах о типах, вовлеченных в флуктуации, и их динамике во времени расходятся: Lackner et al. оценили 20 пациентов с САК (Fisher II, III и IV) в первые пятнадцать дней после кровотечения и обнаружили более высокие уровни микрочастиц тромбоцитов, эндотелия, эритроцитов и лейкоцитов в крови по сравнению со здоровым контролем [28]. Кроме того, положительный эндотелиальный тип маркеров кластера дифференцировки (CD) 105 и CD 62 был особенно повышен у пациентов с вазоспазмом, подтвержденным допплерографией. Со спазмом сосудов, связанным с ишемией, также присутствуют особенно высокие уровни CD 41 положительных микрочастиц тромбоцитов. Несмотря на степень инвалидности на момент выписки, уровень микрочастиц выше, чем у полностью выздоровевших пациентов (n=11). Совсем недавно Санборн и соавт. исследование 22 пациентов с САК с массивным распространением крови (Fisher III и IV) подтверждает повышение уровня микрочастиц у этих пациентов. Повышение уровней эндотелиальных и тромбоцитарных микрочастиц также подтверждается, в то время как корреляции с признаками вазоспазма не обнаружено, как на УЗИ (средняя скорость выше 125 см/с в переднем отделе кровообращения, так и выше 100 см/с в заднем круге кровообращения, в дополнение к коэффициент Линдегора выше 3) и ангиографию.

Опубликованные данные не являются единодушными ни в отношении корреляции между вазоспазмом и КТ-признаками ишемии, ни с инвалидностью.

Первичной конечной точкой исследования является оценка:

1) взаимосвязь уровня ОПН и микрочастиц с развитием спазма сосудов/ишемического поражения на КТ, а в последующем и со средне- и отдаленным исходом больных.

Вторичными конечными точками были:

1. Изменения количества ОПН в ликворе и крови больных САК в день кровотечения и после кровоизлияния, т. е. в 1, 2, 3, 5, 7, 9, 11-е сутки.
2. Уровни микрочастиц в ликворе и крови пациентов с САК в день кровотечения и после кровоизлияния, т. е. в дни 1, 2, 3, 5, 7, 9, 11, для оценки как их прогностического значения в отношении вазоспазма, так и корреляции с почечной или ухудшение функции легких и исход через 3-6 мес.
3. Изолированные микрочастицы будут использоваться для активации in vitro почечных и легочных эндотелиальных клеток с целью выявления возможных перекрестных помех и анализа маркеров повреждения эндотелия.

Продолжительность набора составит один год. При поступлении в больницу будет проведена компьютерная томография, а также оценка по шкале Фишера, шкале Ханта и Гесса и шкале Всемирной федерации неврологических хирургов (WFNS). Мы будем регистрировать демографические переменные, т. е. возраст, пол, симптомы в начале заболевания и сопутствующие заболевания.

Ангиография или ангио-КТ будут выполняться в соответствии с передовой клинической практикой для документирования наличия, размера и характеристик открытой аневризмы. Лечение пациентов с САК будет проводиться в соответствии с передовой клинической практикой. Пациенты будут контролироваться с помощью транскраниальной допплерографии, начиная с первого дня и клинически каждый день. Если клинических изменений не произойдет, пациенты будут подвергнуты перфузионной КТ-ангиографии или ангиографии на 7-й день (+/- 1 день). При ухудшении клинического состояния или увеличении скорости допплеровского сканирования (считая спазм сосудов легким при средней скорости внутри церебральной артерии 120-150 см/с, средней 150-200 см/с и тяжелой >200 см/с) следует рассмотреть возможность ангиографии и эндоваскулярного введения нимодипина. по стандартному протоколу терапии. Ангиографический вазоспазм заключается в сужении мозговых артерий, подтвержденном нейрорентгенологом. Клинический вазоспазм определяется как ухудшение сознания (снижение по шкале комы Глазго (ШКГ) на 2 балла) и/или появление нового очагового дефицита после исключения других причин, таких как судороги, повторное кровотечение, лихорадка. Каждое новое КТ-признание ишемии будет регистрироваться с 3-го дня.

Через 3-6 месяцев исход будет оцениваться по GOS-E (Расширенная шкала комы Глазго; 8-балльная шкала, от смерти до хорошего выздоровления, без какой-либо инвалидности, связанной с САК). Для получения этой информации обученный персонал опрашивает либо самого пациента, либо его близкого родственника.

Биологические образцы будут взяты при поступлении, то есть в течение 24 часов с момента кровотечения, а также в дни 1, 2, 3, 5, 7, 9, 11. Стерильный ликвор будет отбираться из мешка, удаленного от камеры для сбора, в количестве 10 мл/штуцер в одно и то же время каждый день. Кровь в количестве 3 мл/уп и моча будут собираться одновременно (около 7 часов утра). Ликвор, плазму и мочу центрифугируют (2500 об/мин в течение 30 минут), а супернатанты делят на аликвоты и замораживают при температуре -80°С до проведения анализа. Анализ OPN будет выполняться с помощью коммерческого набора для твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) в соответствии с рекомендациями производителя (AssayDesigns Inc., Мичиган; Pierce Biotechnology Inc., Рокфорд, Иллинойс). Чтобы лучше описать воспалительную реакцию, будут измеряться основные цитокины Т-хелперов 1 (Th) 1 и Th2, а также маркеры повреждения головного мозга (энолаза, специфичная для нейронов (NSE), асимметричный диметиларгинин (ADMA) и т. Д.). В моче будут количественно определены маркеры раннего доклинического нарушения. Выделение и характеристика микрочастиц будут выполняться с помощью Nanosight на основе размера и концентрации, а основные поверхностные антигены будут идентифицированы с помощью цитофлуориметрии с указанием происхождения: лейкоциты, эритроциты, тромбоциты, эндотелиальные клетки. Анализ in vitro будет проводиться на монослое почечных и легочных эндотелиальных клеток. Водный баланс, креатинин, число лейкоцитов, инфекция/колонизация, нефротоксические препараты будут контролироваться ежедневно.

Эффект микрочастиц будет оцениваться in vitro на эндотелиальных клетках пуповины (HUVEC), гладкомышечных клетках (SMC), легочных и почечных эндотелиальных клетках, инкубированных с очищенными микрочастицами, полученными из плазмы пациентов, и без них. Кроме того, будет проведен анализ для оценки: апоптоза (окрашивание Тунеля), ангиогенеза (доказательства капилляроподобных структур на планшете Matrigen), адгезии лейкоцитов и экспрессии молекул адгезии.

Поскольку в литературе отсутствуют данные об уровнях ОПН при САК, а данные по микрочастицам неоднозначны, реальный размер выборки не рассчитывался. Учитывая, что у 20-30% пациентов ожидалось осложнение вазоспазмом, набор был запланирован из 60 пациентов в год, чтобы получить 12-18 пациентов с вазоспазмом. Участники, соответствующие критериям включения и исключения, будут зачислены как в отделение интенсивной терапии, так и в отделение нейрохирургии больницы Новара-Маджоре-делла-Карита в течение одного года (т. 31 января 2018 г., 30 января 2019 г.). На основании данных о поступлении в прошлом году ожидается 20 пациентов в отделении интенсивной терапии и 40 пациентов в отделении нейрохирургии. В Т0 уровни микрочастиц будут проанализированы у пациентов с вазоспазмом и без него с помощью рангового теста Уилкоксона. С помощью обобщенных паровых уравнений уровни микрочастиц будут сравниваться между пациентами с вазоспазмом или новыми ишемическими событиями и без них. 3 и 6 месяцев ГОС-Э будут сравниваться с использованием теста Крускала-Уоллиса. Связь между числом микрочастиц и частотой возникновения спазма сосудов и ишемии будет определяться с помощью корреляции Спирмена. Значение р менее 0,05 будет порогом статистической значимости. Анализ будет проводиться с помощью STATA. Что касается экспериментов in vitro, то будут проводиться непараметрические тесты.