Evaluering af niveauet og prognostisk relevans af nye neuroinflammationsmarkører ved subaraknoidal blødning (ESA-MICROPN)

Subarachnoid blødning (SAH) består af blodudskillelse i rummet mellem arachnoid og pia mater. Blødning er en konsekvens af cerebral aneurisme ruptur i de fleste tilfælde. Det rammer især kvinder med en gennemsnitsalder på 55 år. På trods af, at forekomsten kun er 9 tilfælde ud af 1000 mennesker om året, fører ung alder og høj dødelighed og sygelighed til at miste flere års sundt liv. Faktisk lider patienter, der overlevede cerebral aneurisme ruptur, af kognitive underskud, adfærdsforstyrrelser og er ude af stand til at vende tilbage til deres tidligere produktivitetsniveau og job. Terapiprioriteter er: forebyggelse af genblødning med endovaskulær behandling (når det er muligt) eller neurokirurgisk aneurisme klipning; forebyggelse af komplikationer forbundet med ekstravasation af blod i subarachnoid tempo, såsom akut hydrocephalusbehandling (der forekommer hos 20% af patienterne), ved ventrikulær ekstern drænagepositionering og forsinket cerebral iskæmi, hovedsagelig på grund af vasospasme, ved endovenøs administration af nimodipin; optimal vedligeholdelse af perfusionstryk. Fra et patofysiologisk synspunkt kan der efter tidlig mekanisk skade forårsaget af aneurismeruptur (på grund af vævsdestruktion som følge af blødningsmasseeffekt, akut hydrocephalus, herniation eller et muligt intraparenkymalt hæmatom) udvikles en subakut skade fra tre til fjorten dage efter blødning , på grund af forsinket cerebral iskæmi. Hovedansvarlige for denne hændelse er vasospasmer, der komplicerer 20-30% af SAH, mikrocirkulationsdysfunktion og mikrotromboemboli. Sekundær skadespatogenese er ikke klar, men inflammation og endothelial apoptose har vist sig at være involveret i vasospasmeudvikling. Desuden viser nogle undersøgelser, at patienter med akut neurologisk dysfunktion har en større risiko for organsvigt, især for lunger og nyrer.

Osteopontin (OPN) er et udskilt ekstracellulært matrixglycoprotein, der spiller flere roller i fysiologiske og patologiske processer, såsom vævsremodellering, fibrose, cellulær migration, apoptoseinhibering og inflammation. Endogen OPN menes at opfylde en beskyttende aktivitet over iskæmisk skade både i hjernen og andre organer, inklusive nyrer. Desuden reducerer rekombinant OPN-administration markant iskæmisk areal i en fokal cerebral iskæmi-model ved en antiapoptotisk virkning. Nylige in vivo undersøgelser af dyremodeller af SAH viste, at OPN spiller en stor rolle; dets administration dæmper cerebral skade, reducerer metalloproteinase 9 og hæmmer inducerbar nitrogenoxidsyntase. Behandling med OPN synes også at forhindre vasospasme, hvilket inducerer en endogen mitogen-aktiveret protein (MAP)-hæmmer, dvs. MAP kinase phosphatase 1, og reducere glatte muskelceller og endotelceller apoptose. Et yderligere forskningsfelt på dette område vedrører mikropartikler, det vil sige mediatorer frigivet af blodplader, leukocytter, erytrocyt- og endotelceller. I modsætning til hvad man plejede at tro, repræsenterer de ikke en form for affaldsmateriale fra apoptotiske koagulationsceller, og nyere undersøgelser viser deres parakrine ad regulatoriske aktivitet. Ved iskæmisk slagtilfælde relaterer niveauerne af endotelmikropartikler direkte til klinisk sværhedsgrad og iskæmisk områdeudvidelse. I typiske parenkymale blødninger er mikropartiklers niveauer højere både i blod og i spiritus og forbundet med et værre klinisk resultat. I SAH er der påvist øgede mikropartikelniveauer, især på blødningsdagen, og mikropartikelniveauer ændrer sig afhængigt af type. På den anden side er data uenige blandt papirer om typer involveret i fluktuationer og deres tidsforløb: Lackner et al. evaluerede 20 SAH-patienter (Fisher II, III og IV) i deres første femten dage efter blødning og fandt højere blodniveauer af blodplade-, endotel-, erytrocyt- og leukocytmikropartikler sammenlignet med raske kontroller [28]. Desuden var endoteltype positiv for cluster of differentiation (CD) 105 og CD 62 markører især øget hos patienter ramt af vasospasme, dokumenteret med doppler. Vasospasme-associeret iskæmi, præsenterer også særligt høje niveauer af blodplade CD 41 positive mikropartikler. På trods af invaliditetsgraden på udskrivelsestidspunktet er mikropartikelniveauerne højere sammenlignet med fuldt restituerede patienter (n=11). For nylig har Sanborn et al. undersøgelse på 22 SAH-patienter med massiv blodspredning (Fisher III og IV) bekræfter forhøjede mikropartikler hos disse patienter. Forhøjelse af niveauer af endotel- og blodplademikropartikler er også verificeret, mens der ikke findes nogen sammenhæng med tegn på vasospasme, i både ultralyd (gennemsnitshastighed højere end 125 cm/s i forreste kredsløb eller højere end 100 cm/s i posterior cirkulation, ud over et Lindegaard-forhold højere end 3) og angiografi.

Publicerede data er ikke enstemmige om hverken sammenhængen mellem vasospasme og CT-scanningsbevis for iskæmi eller med handicap.

Det primære endepunkt for undersøgelsen er at evaluere:

1) sammenhængen mellem OPN- og mikropartikelniveauer og vasospasmeudvikling/iskæmisk læsion ved CT-scanningen og efterfølgende med patientudfald på mellemlang og lang sigt.

Sekundære endepunkter var:

1. Ændringer af OPN-mængde i spiritus og blod hos patienter med SAH på blødningsdagen og efter blødning, dvs. dag 1, 2, 3, 5, 7, 9, 11.
2. Niveauer af mikropartikler i spiritus- og blodpatienter med SAH på dagen for blødning og efter blødning, dvs. dag 1, 2, 3, 5, 7, 9, 11, for at evaluere både deres prædiktive værdi for vasospasme og korrelationen med nyre- eller lungefunktion forværring og 3-6 måneders udfald.
3. Isolerede mikropartikler vil blive brugt til at aktivere in vitro nyre- og pulmonale endotelceller med det formål at fremhæve en mulig krydstale ved at analysere markører for endotelskade.

Rekrutteringsvarighed vil være et år. Ved hospitalsindlæggelse vil der blive udført en CT-scanning samt Fischer-score, Hunt and Hess-score og World Federation of Neurological Surgeons (WFNS)-score. Vi vil registrere demografiske variabler, dvs. alder, køn, symptomer ved debut og co-morbiditet.

Angiografi eller angio-CT-scanning vil blive udført i overensstemmelse med den bedste kliniske praksis for at dokumentere tilstedeværelse, dimension og karakteristika af patenteret aneurisme. SAH-patienters behandling vil blive udført som rutinemæssig klinisk bedste praksis. Patienterne vil blive overvåget med transkraniel doppler begyndende fra dag I og klinisk hver dag. Hvis der ikke sker nogen klinisk forandring, vil patienterne blive underkastet en CT-perfusionsangiografi eller angiografi på dag 7 (+/- 1 dag). Hvis den kliniske tilstand forværres eller dopplerhastigheden stiger (betragter vasospasme som mild, når gennemsnitshastigheden inde i cerebral arterie er 120-150 cm/s, moderat 150-200 cm/s og svær >200 cm/s), vil angiografi og endovaskulær nimodipin blive overvejet iht. til standardprotokolbehandlingen. Angiografisk vasospasme består i indsnævring af cerebrale arterier bekræftet af neuroradiolog. Klinisk vasospasme er defineret som bevidsthedsforringelse (Glasgow coma scale (GCS) 2-point reduktion) og/eller et nyt fokalt underskud, efter at andre årsager er blevet udelukket, såsom anfald, genblødning, feber. Hvert nyt CT-bevis for iskæmi vil blive registreret fra dag 3.

Efter 3-6 måneder vil resultatet blive evalueret af GOS-E (Extended Glasgow Coma Scale; 8 point skala, fra død til øvre god bedring, uden nogen form for handicap tilbage relateret til SAH). For at få disse oplysninger vil uddannet personale interviewe enten patienterne selv eller en nærtstående.

Biologiske prøver vil blive udtaget ved indlæggelsen, dvs. inden for 24 timer efter blødningen, og på dag 1, 2, 3, 5, 7, 9, 11. Steril væske vil blive udtaget fra posen distalt til opsamlingskammeret i en mængde på 10 ml/matrice, på samme tidsramme hver dag. Blod i en mængde på 3 ml/die og urin vil blive opsamlet på samme tid (ca. 7:00). Væske, plasma og urin vil blive centrifugeret (2500 rpm i 30 minutter), og supernatanter vil blive alikvoteret og frosset ved en temperatur på -80°C indtil analyse. OPN-analyse vil blive udført med kommercielt enzym-linked immunosorbent assay (ELISA) kit, efter producentens forslag (AssayDesigns Inc., Michigan; Pierce Biotechnology Inc., Rockford, IL). For bedre at beskrive inflammatorisk respons vil hoved T-hjælper 1 (Th)1 og Th2 cytokiner blive målt samt cerebrale skadesmarkører (enolase neuron specifik (NSE), asymmetrisk dimethylarginin (ADMA) osv.). På urin vil markører for tidlig præklinisk svækkelse blive kvantificeret. Isolering og karakterisering af mikropartikler vil blive udført med Nanosight baseret på dimension og koncentration, mens større overfladeantigener vil blive identificeret i cytofluorimetri, med angivelse af proveniens: leukocyt, erytrocyt, blodplade, endotelceller. In vitro-analyse vil blive udført på nyre- og pulmonale endotelcellers monolag. Vandbalance, kreatinin, leukocyttal, infektion/kolonisering, nefrotoksiske lægemidler vil blive overvåget dagligt.

Mikropartiklers effekt vil blive evalueret in vitro på navlestrengsendotelceller (HUVEC), på glatte muskelceller (SMC), på pulmonale og renale endotelceller, inkuberet med og uden patienters plasmaafledte oprensede mikropartikler. Derudover vil der blive udført analyse for at evaluere: apoptose (tunelfarvning), angiogenese (bevis på kapillærlignende strukturer på matrigenpladen), leukocytadhæsion og adhæsionsmolekyleekspression.

Da der ikke findes data i litteraturen om OPN-niveauer under SAH, og data om mikropartikler ikke er enstemmige, blev en reel prøvestørrelse ikke beregnet. I betragtning af at 20%-30% af patienterne forventedes at være komplicerede med vasospasme, var optagelsen planlagt med 60 patienter på et år for at få 12-18 patienter med vasospasme. Deltagere, der matcher inklusions- og eksklusionskriterier, vil blive indskrevet både på ICU og neurokirurgisk afdeling på Novara Ospedale Maggiore della Carità i løbet af en periode på et år (dvs. 31. januar 2018, 30. januar 2019). Baseret på sidste års indlæggelser forventes 20 patienter på intensivafdeling og 40 patienter på neurokirurgisk afdeling. Ved T0 vil mikropartikelniveauer blive analyseret hos patienter med og uden vasospasme med Wilcoxon rangtest. Med generaliserede dampligninger vil mikropartiklers niveauer blive sammenlignet mellem patienter med og uden vasospasme eller nye iskæmiske hændelser. 3 og 6 måneder GOS-E vil blive sammenlignet med Kruskal-Wallis test. Forholdet mellem antallet af mikropartikler og vasospasme og iskæmiforekomst vil blive defineret med Spearman-korrelation. En værdi på p mindre end 0,05 vil være tærsklen for statistisk signifikans. Analyse vil blive udført med STATA. For så vidt angår in vitro-forsøg, vil der blive udført ikke-parametriske tests.