Utvärdering av nivån och prognostisk relevans av nya neuroinflammationsmarkörer vid subaraknoidal blödning (ESA-MICROPN)

Subaraknoidal blödning (SAH) består av blodextravasation in i utrymmet mellan spindelvävnad och pia mater. Blödning är en följd av cerebral aneurysm bristning i de flesta fall. Det drabbar särskilt kvinnor med en medelålder på 55 år. Trots att incidensen endast är 9 fall av 1000 personer per år, leder ung ålder och hög mortalitet och sjuklighet till att man förlorar flera år av friskt liv. Faktum är att patienter som överlevde cerebral aneurysm ruptur lider av kognitiva brister, beteendestörningar och kan inte komma tillbaka till sin tidigare produktivitetsnivå och jobb. Terapiprioriteringar är: förebyggande av återblödning, med endovaskulär behandling (när det är möjligt) eller neurokirurgisk aneurismklippning; förebyggande av komplikationer associerade med blodextravasation till subaraknoidal takt, såsom akut hydrocefalusbehandling (som förekommer hos 20 % av patienterna), genom placering av ventrikulär extern dränering och fördröjd cerebral ischemi, huvudsakligen på grund av vasospasm, genom endovenös administrering av nimodipin; optimalt underhåll av perfusionstrycket. Under en patofysiologisk synvinkel, efter tidig mekanisk skada, orsakad av aneurysmruptur (på grund av vävnadsdestruktion till följd av blödningsmassaeffekt, akut hydrocefalus, herniering eller ett möjligt intraparenkymalt hematom) kan en subakut skada utvecklas från tre till fjorton dagar efter blödning på grund av fördröjd cerebral ischemi. Huvudsakliga orsaker till denna händelse är vasospasm, som komplicerar 20-30 % av SAH, dysfunktion i mikrocirkulationen och mikrotromboembolism. Sekundär skadepatogenes är inte tydlig, men inflammation och endotelial apoptos har visat sig vara involverade i vasospasmutveckling. Dessutom visar vissa studier att patienter med akut neurologisk dysfunktion har en större risk för organsvikt, särskilt för lungor och njurar.

Osteopontin (OPN) är ett utsöndrat extracellulärt matrisglykoprotein som spelar flera roller i fysiologiska och patologiska processer, såsom vävnadsremodellering, fibros, cellmigration, apoptoshämning och inflammation. Endogen OPN tros uppfylla en skyddande aktivitet mot ischemisk skada både i hjärnan och andra organ, inklusive njure. Dessutom minskar rekombinant OPN-administration markant ischemisk yta i en fokal cerebral ischemimodell, genom en antiapoptotisk verkan. Nyligen genomförda in vivo-studier på djurmodeller av SAH visade att OPN spelar en stor roll; dess administrering dämpar cerebral skada som minskar metalloproteinas 9 och hämmar inducerbart kväveoxidsyntas. Behandling med OPN verkar också förhindra vasospasm, vilket inducerar en endogen mitogenaktiverad protein (MAP)-hämmare, dvs. MAP kinas fosfatas 1, och reducerande av glatta muskelceller och endotelceller apoptos. Ytterligare ett forskningsfält inom detta område rör mikropartiklar, det vill säga mediatorer som frisätts av blodplättar, leukocyter, erytrocyter och endotelceller. I motsats till vad man brukade tro, representerar de inte en form av avfallsmaterial från apoptotiska koagulationsceller och nyare studier visar deras parakrina ad regulatoriska aktivitet. Vid ischemisk stroke relaterar nivåerna av endotelmikropartiklar direkt till klinisk svårighetsgrad och ischemisk areaförlängning. Vid typiska parenkymala blödningar är nivåerna av mikropartiklar högre både i blod och i sprit och förknippas med sämre kliniskt utfall. I SAH har ökade nivåer av mikropartiklar påvisats, särskilt på blödningsdagen, och nivåerna av mikropartiklar ändras beroende på typ. Å andra sidan är data oense bland artiklar om typer som är involverade i fluktuationer och deras tidsförlopp: Lackner et al. utvärderade 20 SAH-patienter (Fisher II, III och IV) under de första femton dagarna från blödning och fann högre blodnivåer av trombocyt-, endotel-, erytrocyt- och leukocytmikropartiklar i jämförelse med friska kontroller [28]. Dessutom var endoteltyp positiva för cluster of differentiation (CD) 105 och CD 62 markörer särskilt ökade hos patienter som drabbats av vasospasm, dokumenterat med doppler. Vasospasmassocierad ischemi, presenterar också särskilt höga nivåer av CD 41-positiva mikropartiklar av trombocyter. Trots invaliditetsgraden vid tidpunkten för utskrivning är nivåerna av mikropartiklar högre jämfört med helt återställda patienter (n=11). På senare tid har Sanborn et al. studie på 22 SAH-patienter med massiv blodspridning (Fisher III och IV) bekräftar förhöjda nivåer av mikropartiklar hos dessa patienter. Förhöjning av nivåerna av endotel- och blodplättsmikropartiklar verifieras också, medan ingen korrelation hittas med tecken på vasospasm, i både ultraljud (medelhastighet högre än 125 cm/s i främre cirkulationen eller högre än 100 cm/s i bakre cirkulation, förutom en Lindegaard-kvot högre än 3) och angiografi.

Publicerade data är inte enhälliga om varken sambandet mellan vasospasm och CT-skanningsbevis för ischemi eller med funktionsnedsättning.

Studiens primära slutpunkt är att utvärdera:

1) korrelationen mellan OPN och mikropartikelnivåer och vasospasmutveckling/ischemisk lesion vid CT-skanningen, och därefter med patientens resultat på medellång och lång sikt.

Sekundära effektmått var:

1. Ändringar av OPN-mängden i sprit och blod från patienter med SAH på dagen för blödning och efter blödning, dvs. dag 1, 2, 3, 5, 7, 9, 11.
2. Mikropartikelnivåer i sprit- och blodpatienter med SAH på dagen för blödning och efter blödning, dvs. dag 1, 2, 3, 5, 7, 9, 11, för att utvärdera både deras prediktiva värde för vasospasm och korrelationen med njur- eller lungfunktion försämrad och 3-6 månaders utfall.
3. Isolerade mikropartiklar kommer att användas för att aktivera in vitro njur- och lungendotelceller i syfte att belysa en möjlig överhörning, analysera markörer för endotelskada.

Rekryteringstiden kommer att vara ett år. Vid sjukhusvistelse kommer en datortomografi att utföras samt Fischer-poäng, Hunt and Hess-poäng och World Federation of Neurological Surgeons (WFNS) poäng. Vi kommer att registrera demografiska variabler, dvs ålder, kön, symtom vid debut och samsjuklighet.

Angiografi eller angio-CT-skanning kommer att utföras enligt bästa kliniska praxis för att dokumentera förekomst, dimension och egenskaper hos patentaneurysm. SAH-patienters behandling kommer att utföras som rutinmässig klinisk bästa praxis. Patienterna kommer att övervakas med transkraniell doppler från och med dag I och kliniskt varje dag. Om ingen klinisk förändring kommer att inträffa kommer patienterna att genomgå en CT-perfusionangiografi eller angiografi på dag 7 (+/- 1 dag). Om det kliniska tillståndet förvärras eller dopplerhastigheten ökar (med tanke på att vasospasm är mild när medelhastigheten inuti cerebral artär är 120-150 cm/s, måttlig 150-200 cm/s och svår >200 cm/s) kommer angiografi och endovaskulärt nimodipin att övervägas, enligt till standardprotokollbehandlingen. Angiografisk vasospasm består av förträngning av cerebrala artärer bekräftat av neuroradiolog. Klinisk vasospasm definieras som försämring av medvetandet (Glasgow coma scale (GCS) 2 poängs minskning) och/eller ett nytt fokalt underskott uppträder, efter att andra orsaker har uteslutits, såsom kramper, återblödningar, feber. Varje ny CT-bevis på ischemi kommer att registreras från dag 3.

Efter 3-6 månader kommer resultatet att utvärderas av GOS-E (Extended Glasgow Coma Scale; 8 poängs skala, från död till övre god återhämtning, utan någon funktionsnedsättning kvar relaterad till SAH). För att få denna information kommer utbildad personal att intervjua antingen patienterna själv eller en nära anhörig.

Biologiska prover kommer att tas vid inläggningen, det vill säga inom 24 timmar från blödningen, och dag 1, 2, 3, 5, 7, 9, 11. Steril vätska kommer att tas från påsen distalt till uppsamlingskammaren, i en mängd av 10 ml/matris, vid samma tidsram varje dag. Blod i en mängd av 3 ml/dö och urin kommer att samlas in samtidigt (cirka kl. 07.00). Sprut, plasma och urin kommer att centrifugeras (2500 rpm under 30 minuter) och supernatanter kommer att alikvoteras och frysas vid en temperatur av -80°C fram till analys. OPN-analys kommer att utföras med kommersiell enzymkopplad immunosorbentanalys (ELISA) kit, efter tillverkarens förslag (AssayDesigns Inc., Michigan; Pierce Biotechnology Inc., Rockford, IL). För att bättre beskriva inflammatorisk respons, kommer huvudsakliga T-hjälpare 1 (Th)1- och Th2-cytokiner att mätas samt cerebrala skademarkörer (enolasneuronspecifik (NSE), asymmetrisk dimetylarginin (ADMA) etc.). På urin kommer markörer för tidig preklinisk funktionsnedsättning att kvantifieras. Isolering och karakterisering av mikropartiklar kommer att utföras med Nanosight baserat på dimension och koncentration, medan viktiga ytantigener kommer att identifieras i cytofluorimetri, med angivande av proveniens: leukocyter, erytrocyter, blodplättar, endotelceller. In vitro-analys kommer att utföras på monolager av njur- och lungendotelceller. Vattenbalans, kreatinin, antal leukocyter, infektion/kolonisering, nefrotoxiska läkemedel kommer att övervakas dagligen.

Mikropartiklars effekt kommer att utvärderas in vitro på endotelceller från navelsträngen (HUVEC), på glatta muskelceller (SMC), på lung- och njurendotelceller, inkuberade med och utan patientens plasmahärledda renade mikropartiklar. Dessutom kommer analys att utföras för att utvärdera: apoptos (tunelfärgning), angiogenes (bevis på kapillärliknande strukturer på matrigenplattan), leukocytadhesion och adhesionsmolekylexpression.

Eftersom inga data finns i litteraturen om OPN-nivåer under SAH och data om mikropartiklar inte är enhälliga, beräknades inte en verklig provstorlek. Med tanke på att 20%-30% av patienterna förväntades vara komplicerade med vasospasm, planerades inskrivningen med 60 patienter på ett år för att få 12-18 patienter med vasospasm. Deltagare som matchar inklusions- och exkluderingskriterier kommer att skrivas in både på intensivvårdsavdelningen och neurokirurgiska avdelningen på Novara Ospedale Maggiore della Carità under en årsperiod (dvs. 31 januari 2018, 30 januari 2019). Baserat på förra årets inläggningar förväntas 20 patienter på intensivvårdsavdelningen och 40 patienter på neurokirurgisk avdelning. Vid T0 kommer nivåerna av mikropartiklar att analyseras hos patienter med och utan vasospasm med Wilcoxon rank test. Med generaliserade ångekvationer kommer nivåerna av mikropartiklar att jämföras mellan patienter med och utan vasospasm eller nya ischemiska händelser. 3 och 6 månader GOS-E kommer att jämföras med Kruskal-Wallis test. Relationen mellan antalet mikropartiklar och vasospasm och förekomst av ischemi kommer att definieras med Spearman-korrelation. Ett värde på p mindre än 0,05 kommer att vara tröskeln för statistisk signifikans. Analys kommer att utföras med STATA. När det gäller in vitro-experiment kommer icke-parametriska tester att utföras.