Disfunção Vascular na DII Pediátrica

Plano de Investigação:

Pacientes: 130 crianças e adolescentes (8-21 anos) com uma proporção esperada de 60% (n=78) Doença de Crohn (DC), 35% (n=45) Colite ulcerativa (CU) 5% (n=6) Colite indeterminada (CI). Serão investigados 78 controles pareados por idade e sexo. Os cálculos do tamanho da amostra são baseados em Células Endoteliais Circulantes (CECs) como o ponto final primário, conforme sugerido por um estudo em andamento por um dos co-requerentes, em crianças saudáveis ​​e crianças com doença de Kawasaki (Brogan P et al, ref Publicados).

São necessários 40 indivíduos/grupo para detectar uma média duplicada de CECs em DC e UC vs. controle com poder de 90%, significância de 0,05 e isso deve ser alcançado por nosso recrutamento inicial. A não normalidade e a necessidade de usar não paramétrico ou transformada antes da análise, aumenta o número para 47; assim, pretendemos recrutar 50 para o grupo UC. Isso fornecerá poder adequado e é viável com base na coorte clínica disponível para nós.

Esta coorte de pacientes é um grupo candidato apropriado para a presente investigação, pois

1. As evidências indicam que as alterações vasculares que ocorrem entre 10 e 20 anos de idade são um determinante crítico da saúde vascular futura;
2. A iniciação nos hábitos tabágicos é mais provável na adolescência e
3. Outros fatores de risco tradicionais estabelecidos para aterosclerose (como hipertensão, diabetes tipo II ou mesmo doença aterosclerótica totalmente estabelecida) que atuariam como variáveis ​​de confusão ainda não estão presentes na adolescência.

Os dados serão agrupados em uma planilha de Excel não identificada e incluirão idade, sexo, idade no diagnóstico, estado da artéria coronária na apresentação, crescimento, índice de massa corporal, pressão arterial, histórico familiar de DCV e tabagismo.

Objetivo 1: As crianças com DII têm evidência de uma tendência pró-trombótica mediada por MP? As MPs serão identificadas por citometria de fluxo conforme previamente descrito por nosso grupo19. Resumidamente, o plasma pobre em plaquetas (PPP) será obtido do sangue e armazenado a -80 °C para futuros testes em lote. 200 μL de PPP permitirão a sedimentação de MPs que serão ressuspensos em tampão de ligação de Anexina V (AnV) antes da coloração com FITC- ou ficoeritrina-AnV (BD PharMingen). MPs endoteliais, plaquetárias e derivadas de neutrófilos (EMPs/PMPs/NMPs) e Fator Tecidual (TF) serão enumerados por detecção com anti-humano (epítopo de ativação CD62E, CD41 e CD11b que se liga a neutrófilos ativados, respectivamente, mais controles isotípicos relevantes ). Contas de látex (1,1 μm) são usadas para bloquear MPs < 1,1 μm. O potencial trombótico das MPs será quantificado pela suspensão das MPs em plasma livre de micropartículas (MPFP) controle contendo inibidor de tripsina [inibe a ativação de contato] seguido de exposição ao substrato cálcio-fluorogênico (Z-G-G-R-AMC). A cinética de geração de trombina será registrada até 90min pós-estimulação. Tempo de atraso min, pico de trombina nM, índice de velocidade nM/min e potencial de trombina endógena (ETP) nM × min serão calculados. Para investigar a contribuição relativa de PS e TF para a geração de trombina mediada por MP, as MPs serão pré-incubadas com concentrações crescentes de proteína AnV recombinante ou um anti-TF bloqueador (ou controle de isotipo) antes da análise de trombina.

Objetivo 2. As crianças com DII apresentam evidências de lesão endotelial? Além de investigar a saúde arterial (abaixo), quantificaremos a lesão vascular medindo os CECs. As CECs serão isoladas por extração de esferas imunomagnéticas (com base em um protocolo de consenso internacional) e contadas usando uma câmara de Nageotte/microscopia de fluorescência. A enumeração de CEC é definida como células brilhantes de Ulex-europaeus-lectina de tamanho > 10 μm, com 5 esferas magnéticas anexadas19. Os dados serão analisados ​​no contexto dos dados de EMP (objetivo 1), pois a combinação fornecerá uma visão do grau de lesão endotelial em IBD versus controle.

Objetivo 3. As crianças com DII têm evidência de Doença Arterial Estrutural? A velocidade da onda de pulso (PWV) será um indicador da saúde estrutural arterial. As formas de onda de pressão serão registradas simultaneamente em dois locais (carótida-femoral) usando o software de análise VICORDER (Skidmore Medical Limited);

Objetivo 4. Qual é a relação entre os índices de inflamação e os mediadores estabelecidos da lesão vascular? Os níveis de hs-CRP, amilóide sérico A (SAA), TNF-α, IL-1α, IL-1β, IL-6, MCP-1, VEGF, lipídios em jejum e angiopoietina 1/2 serão correlacionados com avaliação clínica validada de atividade da doença [Paediatric UC Activity Index20 (PUCAI) & Pediatric CD Activity Index (PCDAI)] além de marcadores convencionais (CRP, ESR, D-dímeros e plaquetas na doença ativa e inativa). Em muitos casos, os marcadores circulantes convencionais não se correlacionam com os achados endoscópicos na doença ativa; os marcadores não convencionais podem apresentar maior sensibilidade na detecção daqueles com inflamação ativa em curso.

Metodologia:

1. Coleta de dados clínicos: Os dados clínicos do sujeito serão reunidos em uma planilha de Excel não identificada a partir de um proforma de coleta de dados em papel, conforme usado no estudo piloto. Os dados clínicos coletados incluirão idade, sexo, idade no diagnóstico de DII, estado da artéria coronária na apresentação e atualmente, crescimento e índice de massa corporal, pressão arterial, histórico familiar de doença cardiovascular e tabagismo.
2. A inflamação crônica será avaliada usando Meso Scale Discovery (MSD, Maryland, EUA) detecção eletroquimioluminescente multi-array de plasma: hs-CRP, SAA, TNF-α, IL-6, 8 e 10, MCP-1, VEGF, angiopoietina 1 e 2 (este último mediando o descolamento endotelial na vasculite sistêmica (66). Essa técnica permite que muitos parâmetros sejam analisados ​​a partir de quantidades muito pequenas de sangue e foi usada (conforme as instruções do fabricante) com grande sucesso no estudo piloto; d. A ativação/lesão endotelial será avaliada por: contagem de CEC quantificada por isolamento de contas imunomagnéticas (IB) de sangue total usando contas revestidas com anti-CD146, depois coradas com Ulex conjugado com FITC e enumeradas usando microscopia fluorescente e uma câmara de contagem de Nageotte, conforme descrito anteriormente por nosso grupo e outros (46;67); EMPs expressando CD105, E-selectina, ICAM-1, VCAM-1 CD144, CD31, mas negativos para os marcadores plaquetários CD42a ou CD62P serão quantificados a partir de plasma pobre em plaquetas usando um citômetro de fluxo BD FACSArray conforme descrito anteriormente por nosso grupo (44 ); e. O potencial de reparo endotelial será avaliado em um total de 45 indivíduos (15 de cada grupo: KD CAA+, CAA- e controles saudáveis) avaliando (i) a capacidade da unidade formadora de colônias (CFU) EPC (68) e (ii) EPC potencial para incorporar em estruturas vasculares HUVEC em matrigel (69), e agora realizado rotineiramente por nosso grupo (ver abaixo). As EPCs são preparadas a partir de PBMCs isoladas de 5ml de sangue são colocadas em placas de cultura revestidas com fibronectina humana e mantidas em EGM-2 suplementado com 20% de soro fetal de vitela e 40ng/ml de VEGF. Após 4 dias em cultura, as células não aderentes são removidas por lavagem com solução salina tamponada com fosfato e as células aderentes mantidas em cultura até ao dia 7. As unidades formadoras de colónias EPC precoces são então contadas. As EPCs amplificadas colhidas conforme descrito acima são então marcadas com Di-I-LDL e replantadas com HUVEC no topo de uma camada de matrigel solidificada e incubadas a 37 °C por 24 h. Microscopia fluorescente é usada para avaliar a incorporação de EPCs na rede capilar HUVEC, e a formação de túbulos HUVEC (estrutura exibindo comprimento quatro vezes sua largura) será comparada usando EPC de KD (+/- CAA) para controles saudáveis. Cinco campos independentes são avaliados para cada poço e o número médio de túbulos/×100 campos é determinado. f. A rigidez vascular e a IMT carotídea serão avaliadas por: (i) velocidade da onda de pulso carótida-femoral e carótida-radial (PWV) usando o dispositivo Vicorder (Skidmore Medical Limited); Todas essas técnicas são realizadas rotineiramente por nosso grupo de acordo com as recomendações da AHA (70), conforme ilustrado por nossos dados piloto e nossos estudos publicados anteriormente (71-73).