Alteração das Fibras Elásticas Dérmicas Durante Dermatose Calcificante: Estudo Estrutural por Microscopia Multifotônica (Calciphoton)

É grande a variedade de patologias acompanhadas de depósitos minerais nos tecidos (cânceres, processos infecciosos, doenças ambientais) (1). Na dermatologia, várias patologias estão associadas aos depósitos minerais de cálcio, como a calcifilaxia e o pseudoxantoma elástico (PXE). Até o momento, poucos estudos foram realizados sobre as características químicas dos depósitos minerais cutâneos, suas consequências fisiopatológicas, ocorrência de patologias associadas e suas repercussões nos órgãos humanos.

Isso motivou o projeto de doutorado de Hester COLBOC, M.D., sobre a caracterização de depósitos de cálcio em várias dermatoses calcificantes, incluindo calcifilaxia (2) e sarcoidose (3). Este projeto de pesquisa fundamental é realizado no âmbito de uma colaboração entre o LCP (Instituto de Físico-Química, CNRS, Universidade Paris-Saclay) e AP-HP, em particular nas áreas de uro-nefrologia (litíase urinária) e oncologia (4) (calcificações em câncer de mama e tireóide). Mostramos que as calcificações da pele consistem em carbapatita na calcifilaxia e calcita na sarcoidose. Também mostramos que esses depósitos estão localizados principalmente nas fibras elásticas dérmicas ou da parede dos vasos, sugerindo uma via de nucleação molecular dentro dessas fibras a ser explorada.

Esta descrição estrutural e química é inovadora, mas não responde a todas as questões que se colocam em torno destes depósitos de cálcio: porque é que alguns doentes, que apresentam um equilíbrio fosfocálcico normal, apresentam calcificações cutâneas maciças? Por que, ao contrário, outros pacientes, como alguns pacientes em diálise, apresentam balanços fosfocálcicos extremamente perturbados, mas sem calcificação da pele? Esse paradoxo levanta a possibilidade da existência de "focos de nucleação" no interior das fibras elásticas dérmicas e vasculares, favorecendo a precipitação de depósitos fosfocálcicos em alguns pacientes. Alguns modelos in vitro exploraram esses focos de nucleação nas fibras elásticas. (ref Gourgas et al) Notavelmente, a maioria das dermatoses calcificantes são precedidas por um estado inflamatório cutâneo. Esses fenômenos inflamatórios da pele também podem induzir a precipitação de depósitos de cálcio. Alguns autores especulam, assim, que a elastina é digerida pela metaloproteinase (MMP) na matriz extracelular, criando focos de nucleação que favorecem depósitos fosfocálcicos. Munavalli et al. mostraram um aumento do nível de MMP em amostra urinária de um paciente com calcifilaxia em um contexto de rápida perda de peso (5). Eles hipotetizam que níveis séricos elevados de MMP neste paciente poderiam levar a uma alteração do limite elástico externo e calcificações vasculares. Esta hipótese é suportada, por outro lado, por outros modelos de alteração das fibras elásticas, como durante o envelhecimento da pele (dermatoporose), em que não há inflamação nem calcificação.

A hipótese de fundo do nosso projeto é que a inflamação da pele leva a uma alteração específica das fibras elásticas, que favorece a sua calcificação.

Para explorar esta hipótese, particularmente durante a calcifilaxia e PXE, propomos o uso de microscopia multifóton, uma técnica de imagem disponível no Laboratoire d'Optique et Biosciences (LOB) na Ecole Polytechnique. A microscopia multifotônica foi desenvolvida no início dos anos 90 como uma alternativa à microscopia confocal, para melhorar a imagem em profundidade de tecidos biológicos com resolução submicrométrica. Mais importante ainda, a microscopia multifóton pode combinar vários filões de contraste em paralelo e sem qualquer marcação para identificar os vários elementos de um tecido. Os sinais de geração de segundo harmônico (SHG) permitem imagens específicas de colágeno fibrilar não corado com sensibilidade inigualável, enquanto a fluorescência excitada por dois fótons (2PEF) permite imagens celulares graças a vários cromóforos celulares intrínsecos, bem como imagens de elastina na derme ou em outros tecidos (consulte Figura 1) (6).

A microscopia multifotônica tem sido utilizada em vários estudos da pele, inclusive no LOB (ver Figura 1), que comprovam a alta relevância dessa técnica para a caracterização estrutural das fibras dérmicas, principalmente as fibras de elastina e colágeno, e sua possível alteração. Tem sido aplicada no estudo do envelhecimento da pele, bem como nas patologias que levam à degeneração das fibras elásticas (PXE) ou colágenas (Síndrome de Marfan) (7-9). Essa técnica é, portanto, muito apropriada para explorar a estrutura das fibras elásticas durante fenômenos inflamatórios cutâneos e dermatoses calcificantes.

Paralelamente, o processo inflamatório cutâneo será explorado por outros métodos. A imuno-histoquímica será utilizada para detecção de MMP dérmica e a fluorescência de raios-X (no Synchrotron Soleil, linha Diffabs) será utilizada para evidenciar zinco intradérmico e outros depósitos metálicos, conforme feito em nossos estudos anteriores (Figura 2).

Figura 2: Fluorescência de raios X de biópsia de pele: exemplo de correlação entre infiltrado inflamatório dérmico (A) e presença de Zinco intradérmico (B), aqui durante reação liquenoide em tatuagem (imagens registradas no Soleil Synchrotron, linha Diffabs, por S. Reguer, D. Bazin e H. Colboc).

O principal objetivo do nosso projeto é caracterizar as alterações estruturais das fibras elásticas durante a dermatose calcificante.

Os objetivos secundários são:

• estudar as consequências dos processos inflamatórios cutâneos na alteração das fibras elásticas,
• identificar um possível foco de nucleação para a formação de depósitos de fosfocálcio no interior das fibras elásticas dérmicas e vasculares.

Amostras de pele. O estudo será realizado principalmente em pele humana, mas também em um modelo de camundongo PXE: ABCC6 KO. Mais precisamente, o material estudado no LOB será:

• Biópsias de pele humana já coletadas para o diagnóstico destas dermatoses calcificantes: PXE, calcifilaxia, outras dermatoses inflamatórias calcificantes (paniculite lúpica, dermatomiosite), do laboratório de patologia do hospital Tenon (Dr. Moguelet).
• Como controles, biópsias humanas de pele saudável de pacientes de diferentes idades, (margem de remoção do tumor de pele), do Hospital Tenon. Vamos nos concentrar em pacientes com envelhecimento avançado da pele, especialmente pacientes com elastose solar. Este modelo de alteração de fibras elásticas induzida por UV é um ótimo controle em termos de danos não inflamatórios e não calcificados nas fibras elásticas.
• Biópsias cutâneas do modelo de camundongo de PXE (camundongo ABCC6 KO) e de camundongos de controle correspondentes, da Unidade INSERM 1155, Tenon Hospital.

Protocolos. Todas essas biópsias serão caracterizadas por microscopia multifotônica combinando contrastes 2PEF e SHG para imagens simultâneas de fibras elásticas e colágenas. Numa primeira fase, o protocolo experimental será o seguinte:

• Produção no Tenon Hospital de várias lâminas seriadas de cada biópsia: 1 lâmina não corada ("branca") para imagens multifotônicas, 1 lâmina com coloração morfológica usual (hematoxilina-eosina-safran, HES), 1 lâmina com coloração destacando depósitos de cálcio (Von Kossa ) e 3 lâminas com marcações imuno-histoquímicas das principais MMPs (anticorpos contra MMP-1, 2 e 9).
• geração de imagens em LOB em um microscópio óptico de campo claro padrão (luz transmitida padrão e polarizada, fluorescência, DIC) de todas as lâminas coradas em um grande campo de visão por mosaicagem; identificação de regiões de interesse (ROI) correspondentes a processos inflamatórios, remodelamento tecidual ou depósitos minerais. Observe que os depósitos minerais são revelados pela luz polarizada transmitida ou pelo contraste de fase ou DIC.
• Imagens de fluorescência de raios X no Soleil Synchrotron para identificar os depósitos metálicos presentes nas biópsias, especialmente o Zinco. Isso será feito em colaboração com Dominique Bazin (Instituto de Físico-Química, CNRS, Paris-Saclay University), que tem uma forte experiência em imagem mineral na linha Diffabs.
• Imagens multifotônicas no LOB das regiões de interesse identificadas, ou mesmo em um grande campo de visão, unindo automaticamente vários ladrilhos. Também serão realizadas imagens resolvidas por polarização em áreas muito densas ou em áreas remodeladas para mapear a direção das fibras de colágeno e elastina (10).
• Análise quantitativa automatizada de imagens LOB multifotônicas para medir vários parâmetros relacionados à quantidade e estrutura da elastina. Análises quantitativas automatizadas também serão realizadas em colágeno e outras estruturas de interesse observadas em imagens multifotônicas ou imagens histológicas. Os resultados das diferentes modalidades de imagem serão correlacionados em cada série de lâminas. Observe que a análise automática é essencial para evitar os vieses usuais da análise semiquantitativa e para obter parâmetros estruturais mais informativos. Por exemplo, serão extraídos das imagens de elastina os seguintes parâmetros: a densidade média das fibras elásticas (por cm², na derme papilar e na derme reticular), a distribuição de orientação das fibras elásticas, a entropia e a variância circular desta distribuição, o grau de curvatura das fibras elásticas, sua distância dos depósitos minerais.
• Análise estatística de dados multimodais, com base em testes estatísticos apropriados. Testes não paramétricos a priori (Wilcoxon-Mann-Whitney) serão utilizados tendo em vista o número relativamente pequeno de amostras humanas disponíveis. Serão estudados no mínimo 8 pacientes por grupo, o que deve ser suficiente devido à precisão e reprodutibilidade das medidas automatizadas. Se várias amostras ou séries de imagens forem realizadas no mesmo paciente, testes estatísticos aninhados serão usados ​​(nested t-tests ou nested Wilcoxon).

Em uma segunda etapa e com base nos resultados da primeira etapa, vários itens deste protocolo serão aprimorados para acessar mais informações:

• Imagens multifotônicas serão realizadas em biópsias de pele intacta de murinos para melhor destacar a organização 3D da elastina.
• Imagens de fluorescência avançadas de inflamação serão realizadas em pele murina ex vivo, usando medições espectrais ou FLIM (microscopia de imagem de vida útil de fluorescência)

• A Terceira Geração Harmônica (THG) será usada para visualizar a estrutura dos depósitos minerais.

  1. Bazin D, e outros. Caracterização e alguns aspectos físico-químicos das microcalcificações patológicas. Chem Rev. 10 de outubro de 2012;112(10):5092-120.

É grande a variedade de patologias acompanhadas de depósitos minerais nos tecidos (cânceres, processos infecciosos, doenças ambientais) (1). Na dermatologia, várias patologias estão associadas aos depósitos minerais de cálcio, como a calcifilaxia e o pseudoxantoma elástico (PXE). Até o momento, poucos estudos foram realizados sobre as características químicas dos depósitos minerais cutâneos, suas consequências fisiopatológicas, ocorrência de patologias associadas e suas repercussões nos órgãos humanos.

Isso motivou o projeto de doutorado de Hester COLBOC, M.D., sobre a caracterização de depósitos de cálcio em várias dermatoses calcificantes, incluindo calcifilaxia (2) e sarcoidose (3). Este projeto de pesquisa fundamental é realizado no âmbito de uma colaboração entre o LCP (Instituto de Físico-Química, CNRS, Universidade Paris-Saclay) e AP-HP, em particular nas áreas de uro-nefrologia (litíase urinária) e oncologia (4) (calcificações em câncer de mama e tireóide). Mostramos que as calcificações da pele consistem em carbapatita na calcifilaxia e calcita na sarcoidose. Também mostramos que esses depósitos estão localizados principalmente nas fibras elásticas dérmicas ou da parede dos vasos, sugerindo uma via de nucleação molecular dentro dessas fibras a ser explorada.

Esta descrição estrutural e química é inovadora, mas não responde a todas as questões que se colocam em torno destes depósitos de cálcio: porque é que alguns doentes, que apresentam um equilíbrio fosfocálcico normal, apresentam calcificações cutâneas maciças? Por que, ao contrário, outros pacientes, como alguns pacientes em diálise, apresentam balanços fosfocálcicos extremamente perturbados, mas sem calcificação da pele? Esse paradoxo levanta a possibilidade da existência de "focos de nucleação" no interior das fibras elásticas dérmicas e vasculares, favorecendo a precipitação de depósitos fosfocálcicos em alguns pacientes. Alguns modelos in vitro exploraram esses focos de nucleação nas fibras elásticas. (ref Gourgas et al) Notavelmente, a maioria das dermatoses calcificantes são precedidas por um estado inflamatório cutâneo. Esses fenômenos inflamatórios da pele também podem induzir a precipitação de depósitos de cálcio. Alguns autores especulam, assim, que a elastina é digerida pela metaloproteinase (MMP) na matriz extracelular, criando focos de nucleação que favorecem depósitos fosfocálcicos. Munavalli et al. mostraram um aumento do nível de MMP em amostra urinária de um paciente com calcifilaxia em um contexto de rápida perda de peso (5). Eles hipotetizam que níveis séricos elevados de MMP neste paciente poderiam levar a uma alteração do limite elástico externo e calcificações vasculares. Esta hipótese é suportada, por outro lado, por outros modelos de alteração das fibras elásticas, como durante o envelhecimento da pele (dermatoporose), em que não há inflamação nem calcificação.

A hipótese de fundo do nosso projeto é que a inflamação da pele leva a uma alteração específica das fibras elásticas, que favorece a sua calcificação.

Para explorar esta hipótese, particularmente durante a calcifilaxia e PXE, propomos o uso de microscopia multifóton, uma técnica de imagem disponível no Laboratoire d'Optique et Biosciences (LOB) na Ecole Polytechnique. A microscopia multifotônica foi desenvolvida no início dos anos 90 como uma alternativa à microscopia confocal, para melhorar a imagem em profundidade de tecidos biológicos com resolução submicrométrica. Mais importante ainda, a microscopia multifóton pode combinar vários filões de contraste em paralelo e sem qualquer marcação para identificar os vários elementos de um tecido. Os sinais de geração de segundo harmônico (SHG) permitem imagens específicas de colágeno fibrilar não corado com sensibilidade inigualável, enquanto a fluorescência excitada por dois fótons (2PEF) permite imagens celulares graças a vários cromóforos celulares intrínsecos, bem como imagens de elastina na derme ou em outros tecidos (consulte Figura 1) (6).

A microscopia multifotônica tem sido utilizada em vários estudos da pele, inclusive no LOB (ver Figura 1), que comprovam a alta relevância dessa técnica para a caracterização estrutural das fibras dérmicas, principalmente as fibras de elastina e colágeno, e sua possível alteração. Tem sido aplicada no estudo do envelhecimento da pele, bem como nas patologias que levam à degeneração das fibras elásticas (PXE) ou colágenas (Síndrome de Marfan) (7-9). Essa técnica é, portanto, muito apropriada para explorar a estrutura das fibras elásticas durante fenômenos inflamatórios cutâneos e dermatoses calcificantes.

Paralelamente, o processo inflamatório cutâneo será explorado por outros métodos. A imuno-histoquímica será utilizada para detecção de MMP dérmica e a fluorescência de raios-X (no Synchrotron Soleil, linha Diffabs) será utilizada para evidenciar zinco intradérmico e outros depósitos metálicos, conforme feito em nossos estudos anteriores (Figura 2).

Figura 2: Fluorescência de raios X de biópsia de pele: exemplo de correlação entre infiltrado inflamatório dérmico (A) e presença de Zinco intradérmico (B), aqui durante reação liquenoide em tatuagem (imagens registradas no Soleil Synchrotron, linha Diffabs, por S. Reguer, D. Bazin e H. Colboc).

O principal objetivo do nosso projeto é caracterizar as alterações estruturais das fibras elásticas durante a dermatose calcificante.

Os objetivos secundários são:

• estudar as consequências dos processos inflamatórios cutâneos na alteração das fibras elásticas,
• identificar um possível foco de nucleação para a formação de depósitos de fosfocálcio no interior das fibras elásticas dérmicas e vasculares.

Amostras de pele. O estudo será realizado principalmente em pele humana, mas também em um modelo de camundongo PXE: ABCC6 KO. Mais precisamente, o material estudado no LOB será:

• Biópsias de pele humana já coletadas para o diagnóstico destas dermatoses calcificantes: PXE, calcifilaxia, outras dermatoses inflamatórias calcificantes (paniculite lúpica, dermatomiosite), do laboratório de patologia do hospital Tenon (Dr. Moguelet).
• Como controles, biópsias humanas de pele saudável de pacientes de diferentes idades, (margem de remoção do tumor de pele), do Hospital Tenon. Vamos nos concentrar em pacientes com envelhecimento avançado da pele, especialmente pacientes com elastose solar. Este modelo de alteração de fibras elásticas induzida por UV é um ótimo controle em termos de danos não inflamatórios e não calcificados nas fibras elásticas.
• Biópsias cutâneas do modelo de camundongo de PXE (camundongo ABCC6 KO) e de camundongos de controle correspondentes, da Unidade INSERM 1155, Tenon Hospital.

Protocolos. Todas essas biópsias serão caracterizadas por microscopia multifotônica combinando contrastes 2PEF e SHG para imagens simultâneas de fibras elásticas e colágenas. Numa primeira fase, o protocolo experimental será o seguinte:

• Produção no Tenon Hospital de várias lâminas seriadas de cada biópsia: 1 lâmina não corada ("branca") para imagens multifotônicas, 1 lâmina com coloração morfológica usual (hematoxilina-eosina-safran, HES), 1 lâmina com coloração destacando depósitos de cálcio (Von Kossa ) e 3 lâminas com marcações imuno-histoquímicas das principais MMPs (anticorpos contra MMP-1, 2 e 9).
• geração de imagens em LOB em um microscópio óptico de campo claro padrão (luz transmitida padrão e polarizada, fluorescência, DIC) de todas as lâminas coradas em um grande campo de visão por mosaicagem; identificação de regiões de interesse (ROI) correspondentes a processos inflamatórios, remodelamento tecidual ou depósitos minerais. Observe que os depósitos minerais são revelados pela luz polarizada transmitida ou pelo contraste de fase ou DIC.
• Imagens de fluorescência de raios X no Soleil Synchrotron para identificar os depósitos metálicos presentes nas biópsias, especialmente o Zinco. Isso será feito em colaboração com Dominique Bazin (Instituto de Físico-Química, CNRS, Paris-Saclay University), que tem uma forte experiência em imagem mineral na linha Diffabs.
• Imagens multifotônicas no LOB das regiões de interesse identificadas, ou mesmo em um grande campo de visão, unindo automaticamente vários ladrilhos. Também serão realizadas imagens resolvidas por polarização em áreas muito densas ou em áreas remodeladas para mapear a direção das fibras de colágeno e elastina (10).
• Análise quantitativa automatizada de imagens LOB multifotônicas para medir vários parâmetros relacionados à quantidade e estrutura da elastina. Análises quantitativas automatizadas também serão realizadas em colágeno e outras estruturas de interesse observadas em imagens multifotônicas ou imagens histológicas. Os resultados das diferentes modalidades de imagem serão correlacionados em cada série de lâminas. Observe que a análise automática é essencial para evitar os vieses usuais da análise semiquantitativa e para obter parâmetros estruturais mais informativos. Por exemplo, serão extraídos das imagens de elastina os seguintes parâmetros: a densidade média das fibras elásticas (por cm², na derme papilar e na derme reticular), a distribuição de orientação das fibras elásticas, a entropia e a variância circular desta distribuição, o grau de curvatura das fibras elásticas, sua distância dos depósitos minerais.
• Análise estatística de dados multimodais, com base em testes estatísticos apropriados. Testes não paramétricos a priori (Wilcoxon-Mann-Whitney) serão utilizados tendo em vista o número relativamente pequeno de amostras humanas disponíveis. Serão estudados no mínimo 8 pacientes por grupo, o que deve ser suficiente devido à precisão e reprodutibilidade das medidas automatizadas. Se várias amostras ou séries de imagens forem realizadas no mesmo paciente, testes estatísticos aninhados serão usados ​​(nested t-tests ou nested Wilcoxon).

Em uma segunda etapa e com base nos resultados da primeira etapa, vários itens deste protocolo serão aprimorados para acessar mais informações:

• Imagens multifotônicas serão realizadas em biópsias de pele intacta de murinos para melhor destacar a organização 3D da elastina.
• Imagens de fluorescência avançadas de inflamação serão realizadas em pele murina ex vivo, usando medições espectrais ou FLIM (microscopia de imagem de vida útil de fluorescência)

• A Terceira Geração Harmônica (THG) será usada para visualizar a estrutura dos depósitos minerais.

  1. Bazin D, e outros. Caracterização e alguns aspectos físico-químicos das microcalcificações patológicas. Chem Rev. 10 de outubro de 2012;112(10):5092-120.
  2. H Colboc, e outros. Localização, características morfológicas e composição química de depósitos cutâneos relacionados à calcifilaxia em pacientes com arteriolopatia urêmica calcificada. JAMA Dermatologia 2019.
  3. H Colboc, e outros. Caracterização físico-química de depósitos inorgânicos associados a granulomas na sarcoidose cutânea. Jornal da Academia Europeia de Dermatologia e Venereologia 2018.
  4. Haka AS, et ai. Identificação de microcalcificações em lesões benignas e malignas da mama, sondando diferenças em sua composição química usando espectroscopia Raman. Res. de Câncer 15 de setembro de 2002;62(18):5375-80.
  5. Munavalli G, et al. Calcifilaxia induzida por perda de peso: papel potencial das metaloproteinases de matriz. J Dermatol. 2003;30(12):915-919.
  6. Schanne-Klein MC. "L'imagerie multiphoton des peaux naturelles et synthétiques. Un nouvel outil pour l'évaluation des produits cosmétiques." Photoniques 88 (2017): 21-24.
  7. Wang, Hequn, et al. "Mudanças morfológicas relacionadas à idade da matriz dérmica na pele humana documentadas in vivo por microscopia multifotônica." Journal of biomedical optics 23.3 (2018): 030501.
  8. Cui, Jason Z., e outros. "Quantificação da elastina aórtica e cutânea e morfologia do colágeno na síndrome de Marfan por microscopia multifotônica." Jornal de biologia estrutural 187.3 (2014): 242-253.
  9. Tong, P.L., et al. "Uma abordagem quantitativa para dissecação histopatológica de distúrbios relacionados à elastina usando microscopia multifotônica." British Journal of Dermatology 169.4 (2013): 869-879.
  10. G. Ducourthial, J.-S. Affagard, M. Schmeltz, X. Solinas, M. Lopez-Poncelas, C. Bonod-Bidaud, R. Rubio-Amador, F. Ruggiero, J.-M. Allain, E. Beaurepaire e M.-C. Schanne-Klein, "Monitoramento da reorganização dinâmica do colágeno durante o alongamento da pele com imagens SHG resolvidas por polarização rápida.", J. Biophot. 12, e201800336 (2019).