Implicação da expressão da subunidade 7 do complexo CCR4-NOT na resistência de células assassinas naturais em câncer de mama metastático (CCR4-NOT)

1. Introdução 1.1. Problema de pesquisa. O câncer de mama (CM) é a principal causa de mortes por câncer em mulheres (1,2). A principal causa desta mortalidade é a disseminação metastática para outros órgãos (3). A metástase ocorre quando as células tumorais adquirem características invasivas (4) e a capacidade de escapar da imunidade antitumoral; respostas imunes inatas e adaptativas importantes para o controle do tumor (5,6). Foi relatado que um grande comprometimento da maturação das células natural killer (NK) do sangue periférico e das funções citotóxicas acompanha a progressão do BC (7). Vários estudos de perfil de expressão genética mostraram que um melhor resultado está associado a um forte infiltrado citotóxico contendo células NK (8,9). Estes dados sugerem que a progressão do BC está ligada à eficiência imunológica antitumoral das células NK, células T e células B. No entanto, como a progressão do BC afeta o fenótipo das células NK periféricas não é abundantemente investigado.

A atividade das células NK é determinada pela ativação e inibição de receptores presentes nas células NK que são desencadeados durante o reconhecimento da célula alvo (aqui, célula tumoral), induzindo uma via de sinalização celular positiva ou negativa, respectivamente. A integração destes sinais opostos determina o peso de ativação das células NK (10). Estudos recentes demonstraram que várias moléculas, nomeadamente factores inibitórios, frequentemente encontrados no microambiente tumoral (TME) podem prejudicar drasticamente o fenótipo e as funções das células NK (11,12), resultando numa expressão diminuída de receptores activadores de células NK e num aumento da expressão de os receptores inibitórios (como LAIR-1 que foi detectado anteriormente em amostras clínicas de sangue de CHC, células T-citotóxicas (13). Estes podem promover a progressão do BC e correlacionar-se-iam com a diminuição da função citotóxica das células imunitárias encontrada pelas células NK e células T ou células B (14).

1.2. Meta e objetivos. Para explorar o papel do CNOT7 relacionado à resistência das células imunológicas na metástase do BC, os investigadores tentaram medir os níveis séricos de CNOT7 na coorte de pacientes egípcias com BC em relação aos parâmetros clinicopatológicos. A expressão tecidual de CNOT7 em amostras de tecido BC categorizadas como tumor metastático vs não metastático juntamente com a margem de tecido não tumoral adjacente foi medida. Além disso, quantificou o receptor inibitório nas células NK, nomeadamente; Níveis séricos de LAIR-1, cuja superexpressão estaria ligada às características agressivas do CM e aos resultados clínicos adversos (22) manifestados como TNM. A correlação do CNOT7 com os níveis sanguíneos de LAIR-1 será avaliada clinicamente e confirmada ou implementada por meio de pesquisa em bancos de dados de bioinformática e análise in silico. De acordo com os investigadores, estão procurando o mecanismo de metástase do BC, não apenas explorando os níveis sanguíneos de CNOT7 ou LAIR1, portanto, encontrando mais opções terapêuticas, via acoplamento molecular de CNOT7 ou através do bloqueio de suas vias a jusante ou da interação de redes gene-gene efetoras, seja como potencial promissor opções de tratamento. Onde, esses caminhos e interações serão recuperados da pesquisa de caminhos KEGG, posteriormente abordados por meio de interações extraídas de texto ou pesquisa em bancos de dados de bioinformática in silico com curadoria.

2.1. Participantes do Estudo 2.1.1. Aprovação ética e consentimento informado para participar. A aprovação ética foi obtida do Comitê de Ética em Pesquisa do conselho de revisão da Universidade Ain Shams, Faculdade de Farmácia (REC ID# 48, 20 de outubro de 2021).

2.1.2. O estudo foi realizado de acordo com as diretrizes da Associação Médica Mundial (WMA), cumprindo os princípios éticos da Declaração de Helsinque para pesquisas médicas envolvendo seres humanos, versão revisada de julho de 2018, onde todos os indivíduos participantes assinaram o consentimento informado (TCLE) eticamente aprovado.

2.1.3. Grupos de Pacientes BC. 90 pacientes do sexo feminino com CM, voluntárias no estudo, com diagnóstico de CM invasivo primário (não metastático) (46 pacientes) ou CM metastático (44 pacientes). Os pacientes foram inscritos aleatoriamente no Departamento de Oncologia Clínica da Faculdade de Medicina dos Hospitais Universitários de Mansoura, Universidade de Mansoura, Mansoura, Egito, após assinatura do TCLE.

2.1.4. O diagnóstico de CM foi realizado com mamografia e ressonância magnética (RM). A história completa foi coletada e registrada para todos os participantes do estudo (n = 90).

Foram coletadas amostras de sangue e blocos de parafina tecidual para aqueles que atenderam aos critérios de inclusão e assinaram o TCLE.

2.1.5. Características clínicas e patológicas dos pacientes. Para todos os participantes do BC, foi registrado histórico familiar completo de doença/câncer, bem como o estado diabético dos pacientes (sim vs não), número de gestações (menos ou mais de 2), estado da menopausa (pré vs pós-) e tratamento(s) recebido(s) (quimioterapia neoadjuvante, quimioterapia adjuvante, terapia endócrina ou mastectomia). O estado atual do câncer individual dos pacientes e a avaliação clínica do tumor, feita na Faculdade de Medicina do Hospital Universitário de Mansoura, Universidade de Mansoura, usando a categorização tumor-nódulo-metástase (TNM) de acordo com a 8ª edição do American Joint Committee on Cancer ( AJCC) e a Escala Bloom-Richardson para classificação histológica (24) coletadas dos arquivos de dados dos pacientes, após uma biópsia ter sido realizada no momento da exploração/exame cirúrgico do CM.

Resultados de imunohistoquímica (IHC) para o índice de proliferação Ki-67 (sendo baixo ou alto), status do receptor de estrogênio (ER), receptor de progesterona (PR) e receptor de crescimento epidérmico humano 2 (HER2/neu) (cada um positivo ou negativo), índice de massa corporal (IMC) kg/m2 (normal, sobrepeso e obesidade 18,5-24,9, 25-29,9 e ≥30 kg/m2, respectivamente) (25), status dos linfonodos (LN) (nenhum N0, N1-3, N4-9, ≥ 10) (26) e idade em anos, foram todos coletados dos prontuários dos pacientes e tabulados para análise estatística.

Subtipo molecular de BC (27) se luminal como (ER+ e/ou PR+), superexpressão de HER-2 (ER-, PR-, HER-2+) ou BC triplo negativo (TNBC) (ER-, PR-, HER -2-) e subtipos histológicos de BC (28), se carcinoma ductal invasivo (CDI) ou não, foram todos registrados para análise de correlação.

3. Métodos 3.1. Análise Bioquímica 3.1.1. ELISA 3.1.1.1. CNOT7 ELISA O CNOT7 foi avaliado usando o kit ELISA da subunidade 7 do complexo de transcrição NOT CCR4 humano (CNOT7), Mybiosource, EUA, seguindo as instruções do fabricante. Resumidamente, os padrões e amostras de soro de ambos os grupos BC não metastático e BC metastático foram incubados juntamente com o conjugado CNOT7-HRP numa placa ELISA pré-revestida com anticorpo anti-CNOT7 fornecida pelo fabricante durante uma hora a 37 ° C. Após o período de incubação, os poços foram decantados e lavados cinco vezes manualmente utilizando tampão de lavagem pré-diluído fornecido pelo fabricante. Poços incubados com substrato para enzima HRP por uma hora a 37°C. Finalmente, uma solução de parada foi adicionada para interromper a reação. A intensidade da cor produzida foi medida espectrofotometricamente a 450 nm em leitor de microplacas. Uma curva padrão foi traçada relacionando a intensidade da cor (Densidade Óptica (D.O.)) com a concentração dos padrões. A concentração de CNOT7 em cada amostra foi interpolada a partir desta curva padrão (arquivo suplementar).

3.1.1.2. LAIR-1 ELISA LAIR-1 foi avaliado usando o kit Human LAIR-1 ELISA, Mybiosource, EUA. Os padrões e as amostras foram pipetados nos poços de uma placa ELISA pré-revestida com um anticorpo específico para LAIR-1 fornecido pelo fabricante. A placa foi então coberta e incubada a 37°C por 45 min. seguido por uma etapa de lavagem manual 5 vezes usando tampão de lavagem previamente diluído. Um anticorpo de detecção conjugado com HRP foi adicionado à placa e foi incubado novamente à mesma temperatura durante 30 min. Em seguida, a placa foi lavada conforme explicado anteriormente e incubada com soluções cromogênicas por 15 min. seguido por uma etapa final de adição de solução de parada. A intensidade da cor foi medida espectrofotometricamente a 450 nm em leitor de microplacas. Uma curva padrão é traçada relacionando a intensidade da cor (D.O.) à concentração dos padrões. A concentração de LAIR-1 em cada amostra foi interpolada a partir desta curva padrão (arquivo suplementar). Os padrões foram preparados a partir de uma solução estoque e um diluente padrão fornecido pelo fabricante produzindo uma série de diluições de 2 vezes 3.1.1.3. s.Insulin ELISA O ensaio de insulina sérica foi realizado utilizando o kit ELISA da Hyperion Inc., Miami, FL, EUA. A intensidade da cor da amostra de teste está diretamente inversamente relacionada à sua concentração de insulina. O nível normal de insulina para adultos é de 0-25 mU/L.

3.1.2. Imunohistoquímica 3.1.2.1. Protocolo de coloração CNOT7 IHC Usando seções de parafina montadas em lâminas carregadas positivamente usando a técnica do complexo avidina-biotina-peroxidase (ABC) (29). Seções de cada grupo foram tratadas com CNOT7 (M01) (ABNOVA, Cat# H00029883-M01, Anticorpo monoclonal, Clone 2F6) na diluição 1:25 antes de serem expostas aos produtos químicos necessários para o método ABC (kit Vectastain ABC-HRP, Vector laboratórios). Para detectar complexos antígeno-anticorpo, a expressão do marcador foi marcada com peroxidase e colorida com diaminobenzidina (DAB, fabricada pela Sigma). Os controles negativos foram incluídos utilizando soro não imune no lugar dos anticorpos primários ou secundários. O microscópio Leica (CH9435 Hee56rbrugg) (Leica Microsystems, Suíça) foi utilizado para avaliar seções coradas por IHC (Leica Microsystems, Suíça).

3.1.2.2. Avaliação quantitativa dos resultados do CNOT7 IHC "Área %" Em cada seção seriada dos grupos de pacientes analisados, seis campos de alto aumento (x 400) com imunomarcação marrom positiva foram escolhidos para exame. A% de área das seções coradas com CNOT7 foi calculada usando o sistema de computador analisador de imagem Leica QWin 500 (Reino Unido). Este analisador de imagens envolveu um microscópio Leica, uma câmera de vídeo colorida, um monitor colorido e um disco rígido de um computador pessoal Leica IBM conectado ao microscópio e gerenciado pelo software Leica QWin 500.

Os dados de % de área foram relatados estatisticamente em termos de média e erro padrão da média (média ± SEM) para oito imagens de quatro amostras não metastáticas e quatro amostras metastáticas.

3.2. Análise Bioinformática in silico 3.2.1. Minerador de expressão genética de câncer de mama v5.0 (bc-GenExMiner v5.0) Atualizado em 28 de junho de 2023.

http://bcgenex.ico.unicancer.fr/BC-GEM/GEM-Accueil.php?js=1 (30) para explorar a correlação entre CNOT7 e LAIR1.

3.2.2. Módulo de função do LinkedOmics usado para realizar análise do processo biológico de Gene Ontology (GO_BP) com análise de enriquecimento de conjunto de genes (GSEA) http://www.linkedomics.org/ (31).

3.2.3. Interações gene-gene e caminhos de bancos de dados com curadoria in silico e mineração de texto via Genome Browser para genes alvo usando Universidade da Califórnia Santa Cruz (UCSC) (32) Instituto de genômica http://genome.ucsc.edu/index.html As interações dos genes LAIR1 e CNOT7 foram recuperadas, com menção de medicamentos inibidores conhecidos do DrugBank.

3.2.4. Interação proteína-proteína (PPI) do banco de dados Ferramenta de pesquisa para recuperação de genes/proteínas interagentes (STRING) versão 11.5 https://string-db.org/ que prevê interações com base em dados experimentais relevantes, resultados de sequenciamento e literatura de >1100 organismos totalmente sequenciados (33). Acessado em 20 de janeiro de 2023, para explorar proteínas que interagem com LAIR-1.

https://string-db.org/cgi/network?taskId=bQyD5DID27nM&sessionId=bFHqdPHoGJPF 3.2.5. Explorando padrões de expressão gênica em tecidos normais e tumorais (GENT2) com sobrevivência http://gent2.appex.kr/gent2/ 3.3. Ancoragem molecular: 3.3.1. Preparação das estruturas proteicas de LAIR-1 e CNOT7 https://www.protocols.io/view/protein-ligand-docking-using-moe-bnxxmfpn?step=2 Do banco de dados de proteínas (PDB) https:// www.rcsb.org/search a estrutura cristalina do Human LAIR-1 (PDB ID: 3RP1) https://www.rcsb.org/structure/3RP1 Após carregar as estruturas em ambiente operacional molecular (MOE) https://www.chemcomp.com/Products.htm Plataforma Integrada de Design Molecular Auxiliada por Computador, eles foram preparados usando os parâmetros padrão no 'Painel QuickPrep' incluindo a remoção de moléculas de água, adição de átomos de hidrogênio à estrutura da proteína, ajuste dos estados de protonação e garantia de minimização de energia das estruturas da proteína com Amber10 :Campo de força EHT.

Como essas estruturas cristalinas não foram co-cristalizadas com nenhum ligante, o MOE SiteFinder, um programa para análise de sítios de ligação equipado no MOE, foi usado para prever os possíveis sítios de ligação. Esses bolsões são classificados com base em sua propensão à ligação de ligantes (PLB). CNOT7 é um receptor sem estrutura co-cristalizada de PDB disponível, portanto, os pesquisadores usaram a ferramenta MOE siteFinder para ajudar em nosso estudo, com o guia de literaturas anteriores relatando vários resíduos de aminoácidos essenciais envolvidos nas interações ligante-proteína CNOT7 como Glu247, Tyr260, Glu278 (34,35) foram identificados como relativamente significativos.

3.3.2. Curadoria do conjunto de dados de ligantes O 'programa construtor' implementado no MOE foi usado para modelar seis ligantes no estudo; Vitamina E, Colchicina, Prodigiosina, Riboflavina, Telmisartana e Pioglitazona, onde foram obtidas todas as conformações possíveis no pH fisiológico.

3.3.3. Simulações de acoplamento O acoplamento das conformações obtidas dos seis ligantes foi realizado utilizando algoritmos de posicionamento e refinamento do programa MOE. O acoplamento inicial das moléculas nos sítios ativos utilizou o método de colocação 'Triangle Matcher' e a função de pontuação 'London dG'. O refinamento adicional das poses de ancoragem pós-colocação foi alcançado usando o método de pontuação 'GBVI/WSA dG'. As poses com energia mínima foram utilizadas para visualização das interações de ligação, bem como ocupação do sítio de ligação dos receptores.

3.4. Análise Estatística 3.4.1. Os dados coletados foram registrados e analisados ​​utilizando o software Statistical Package for Social Science (SPSS, Versão 17, Chicago, IL, EUA).

3.4.2. Os dados qualitativos foram apresentados como frequências (n) e percentuais (%). 3.4.3. O teste de normalidade dos dados quantitativos foi realizado utilizando a calculadora Shapiro-Wilk. Variáveis ​​normalmente distribuídas foram representadas como média ± SEM e analisadas por meio do teste t de Student independente de duas amostras para comparação de dois grupos. Os dados com distribuição não normal foram apresentados como medianas (intervalos interquartis do primeiro ao terceiro quartil ou 25º ao 75º quartil) e analisados ​​pelo teste de Mann-Whitney (U).

3.4.4. A curva ROC foi realizada para detectar os melhores pontos de corte para categorizar os níveis séricos de CNOT7 e LAIR-1 em subgrupos de baixa e alta expressão.

3.4.5. O teste Qui-quadrado foi utilizado para avaliar a associação entre os níveis séricos de CNOT7 e os parâmetros clinicopatológicos. O teste de correlação de Pearson foi utilizado para avaliar a associação entre variáveis ​​paramétricas. Correlações ponto-bisserial foram utilizadas para determinar a correlação entre os parâmetros quando um deles era uma variável dicotômica.

3.4.6. O nível de significância foi estabelecido em P<0,05 e nível de confiança (IC) ou intervalo de 95% e 5%, respectivamente.