PMPR e Clorexidina na Doença Periodontal e Função Vascular (CHX-PMPR-PERIV)

Braço 2 - Os participantes neste braço receberão PMPR com aparelhos de ultrassons na linha de base (Visita 1) como parte dos cuidados de rotina. Na Visita 2 (Dia 1), os participantes serão aleatoriamente designados para receber um elixir bucal placebo, idêntico em sabor, cor e aparência ao elixir bucal de clorexidina.

- Este comparador placebo permitirá avaliar o efeito da clorexidina versus nenhum tratamento antibacteriano ativo, mantendo os participantes e investigadores cegos. Os participantes seguem o mesmo regime (10 ml de bochecho, 1 minuto, duas vezes ao dia durante 14 dias), com recolha de saliva, AEP, sangue e medições da função vascular na linha de base, Dia 1, Dia 14 e Dia 90.

• Braço 1
• Os participantes neste braço receberão PMPR com raspadores ultrassónicos na linha de base (Visita 1), como parte dos seus cuidados padrão. Na Visita 2 (Dia 1), serão randomizados para receber elixir bucal de clorexidina a 0,2% (10 ml, 1 min, duas vezes ao dia durante 14 dias), com recolha de saliva, Película Adquirida do Esmalte (AEP), amostra de sangue e medições da função vascular realizadas na linha de base (Dia 0), Dia 1, Dia 14 e Dia 90.

• Colutório de Clorexidina

Objetivo: Identificar proteínas inflamatórias e protetoras, monitorizar alterações pós-PMPR na saliva.

• Método (Protocolo do Imperial College, Londres):
• Redução e Alquilação: Uma alíquota de 10 µL de saliva será descongelada e misturada com 7 µL de tampão de bicarbonato de amónio em gelo. Para redução e alquilação, serão adicionados 5 µL de TCEP e CAA, mantendo um pH de 7-8 para garantir a modificação adequada das ligações dissulfureto e dos resíduos de cisteína.
• Protocolo SP4: Após redução e alquilação, o protocolo SP4 será implementado adicionando 80 µL de acetonitrila de grau LC/MS para precipitar as proteínas; a mistura será centrifugada para separar o sobrenadante, e o precipitado será lavado três vezes com etanol para uma purificação completa.
• Digestão: O precipitado purificado será então ressuspenso em tripsina de estoque, adicionando 20 µL de bicarbonato de amónio 25 mM à tripsina em pó liofilizada (tripsina modificada de grau de sequenciação em pó) e incubado durante a noite a 37°C.

- A amostra de saliva total não estimulada da boca (uWMS) será utilizada para medir a taxa de fluxo salivar. A taxa de fluxo salivar (mL/min) é calculada como:

Taxa de fluxo salivar (mL/min) = (Peso do tubo com saliva - Peso do tubo vazio) ÷ Tempo de recolha (min).

• Uma amostra de saliva total não estimulada (uWMS) será utilizada para medir o pH salivar.
• Após a recolha da saliva, o pH salivar será medido utilizando um medidor de pH digital de eletrodo único (Lutron Electronic Enterprise Co., Ltd., Modelo PH-208, Taiwan).

• A composição microbiana da saliva será caracterizada através de extração de ADN e sequenciação do ARNr 16S para observar alterações no microbioma oral após PMPR.
• Objetivo: Caracterizar alterações no microbioma oral após PMPR.
• Método/técnicas: Extração de ADN; sequenciação do ARNr 16S.
• O ADN genómico bacteriano será extraído de amostras de WMS e AEP utilizando métodos padrão ou kits comerciais. O ADN extraído servirá como modelo para a amplificação por PCR de fragmentos do gene ARNr 16S (500-1.500 pb). - As amostras de saliva e película preparadas serão enviadas para o Laboratório de Investigação do Microbioma Oral da Universidade Temple (EUA) para extração de ADN e sequenciação do ARNr 16S, estando em vigor um Acordo de Transferência de Material (MTA). - O ADN microbiano será extraído de 1-3 mL de amostras utilizando kits Qiagen QIAamp ou Vazyme VAMNE. A quantificação do ADN será realizada através de métodos fluorométricos (Qubit), e a pureza será avaliada por absorvância. Três controlos em branco de água estéril serão incluídos.

- O perfil proteico será avaliado em AEP. O objetivo é compreender as alterações proteicas protetoras vs. patogénicas da superfície dentária. A película será recolhida usando tiras de filtro; eluição e análise proteica.

Parâmetros Avaliados: Variações estruturais e funcionais das proteínas (tais como albumina, cistatinas, mucinas, PRPs). - Objetivo: Detetar e comparar alterações-chave nas proteínas estruturais ao longo dos pontos temporais do estudo. - Métodos/técnicas: SDS-PAGE e Western blot. A eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecilsulfato de sódio (SDS-PAGE) é um método de eletroforese descontínua comumente utilizado para separar proteínas com pesos moleculares entre 5 e 250 kDa. O SDS atua como um surfactante, mascarando as cargas naturais das proteínas e conferindo-lhes rácios carga/massa quase idênticos. Sob um campo elétrico constante, as proteínas migram para o ânodo a velocidades determinadas pela sua massa, permitindo uma separação precisa baseada no tamanho. O Western blot é uma técnica molecular utilizada para detetar e quantificar proteínas específicas.

• Objetivo: Avaliar a capacidade de redução de nitrato da microbiota oral.
• Avaliar o papel bacteriano nas vias do óxido nítrico.
• Método: Enxaguamento com nitrato; incubação; centrifugação; quantificação de nitrito.

Para avaliar a atividade de redução de nitrato em amostras de WMS, será preparada uma solução estoque dissolvendo 1011 mg de nitrato de potássio em 1 L de água ultrapura. Alíquotas de 10 mL serão armazenadas em tubos Falcon de 15 mL a -20°C até serem utilizadas.

• Para o procedimento, uma alíquota será descongelada e utilizada como solução de enxaguamento. Os participantes irão enxaguar a boca com 10 mL da solução durante 5 minutos sob supervisão cronometrada. O enxaguamento expectorado será recolhido num tubo Falcon de 50 mL e transferido para tubos de microcentrífuga.
• As amostras serão centrifugadas a 10 000 rpm durante 10 minutos. O sobrenadante será recolhido, transferido para um novo tubo e armazenado a -20°C para posterior análise da concentração de nitrito.

• A FMD da artéria braquial será utilizada para avaliar a função endotelial após um estímulo isquémico de 5 minutos induzido pela insuflação de um manguito no antebraço. As medições serão realizadas em decúbito dorsal no braço direito, com o manguito colocado distal ao processo olecraniano.
• Uma sonda de ultrassom linear de 12 MHz será utilizada para visualizar a artéria braquial, registando simultaneamente imagens modo-B e traçados de velocidade do fluxo sanguíneo Doppler. As definições de profundidade, foco e ganho manter-se-ão consistentes, e a localização do transdutor será documentada para reprodutibilidade.
• Após um período basal de 60 segundos, o manguito será insuflado até 220 mmHg durante 5 minutos. As gravações de ultrassom continuarão durante a insuflação e durante 3 minutos após a desinsuflação. Todos os exames serão realizados pelo mesmo investigador para cada participante.
• O diâmetro da artéria braquial, o fluxo sanguíneo e a taxa de cisalhamento serão analisados utilizando software automático de deteção de bordas e seguimento da parede para minimizar o viés do investigador.

• A iontoforese será utilizada para avaliar a função endotelial microvascular através da administração transdérmica de fármacos com uma corrente elétrica de baixa intensidade. Os participantes irão aclimatizar-se durante 30 minutos numa sala mantida a 23°C antes de receberem acetilcolina (ACh, 1%) e nitroprussiato de sódio (SNP, 0,01%) na face volar do antebraço.
• A pele será limpa com água para injeção, e dois anéis de perspex serão colocados como ânodo e cátodo, ligados ao controlador de iontoforese. Cada câmara conterá 0,5 mL da solução do fármaco. O protocolo de estimulação incluirá quatro impulsos a 25 μA, seguidos de impulsos únicos a 50, 100, 150 e 200 μA, cada um com duração de 20 segundos e intervalos de 120 segundos.
• O fluxo sanguíneo cutâneo será medido utilizando sondas de Laser Doppler ligadas a um monitor de perfusão, com os dados registados através do software PowerLab e LabChart. A condutância vascular cutânea (CVC) será calculada como fluxo cutâneo/PAM.

• O débito cardíaco (DC) será medido de forma não invasiva através do dispositivo Physio Flow PF-05 Lab1, com colocação de elétrodos torácicos. Dois elétrodos colocados no manúbrio esternal e na região torácica inferior irão monitorizar o EKG para a frequência cardíaca, enquanto quatro elétrodos na base do pescoço e no processo xifoide irão medir os sinais de impedância.
• A pele será preparada através de depilação e limpeza para otimizar a qualidade do sinal. Para participantes com pacemakers, os elétrodos do pescoço serão posicionados em oposição ao dispositivo. A calibração será realizada através da aquisição de sinais estáveis ao longo de 30 batimentos cardíacos, com medição simultânea da pressão arterial.
• O sistema irá fornecer a frequência cardíaca, o volume sistólico, o DC e outros parâmetros hemodinâmicos, sendo os dados revistos e armazenados para análise.

• A quimioluminescência à base de ozono, um teste bioquímico, será utilizada para medir os metabolitos do óxido nítrico (NO), principalmente o nitrito (NO₂⁻), em amostras de saliva. Neste método, o NO reage com o ozono para produzir uma forma excitada de dióxido de azoto, que é detetada como um sinal quimioluminescente.
• As amostras de saliva serão analisadas para concentrações de nitrito utilizando um analisador de óxido nítrico Sievers (Sievers NOA 280i).

• A quimioluminescência baseada em ozono, um teste bioquímico, será utilizada para medir os metabolitos do óxido nítrico (NO), como o nitrato (NO₃⁻), em amostras de saliva. Neste método, o NO reage com o ozono para produzir uma forma excitada de dióxido de azoto, que é detetada como um sinal quimioluminescente.
• As amostras de saliva serão analisadas quanto às concentrações de nitrato utilizando um analisador de óxido nítrico Sievers (Sievers NOA 280i).

• A pressão arterial na artéria braquial será medida após 30 minutos de repouso sentado numa sala silenciosa, utilizando um esfigmomanómetro automático. Serão realizadas cinco leituras consecutivas, com um intervalo de repouso de 1 minuto entre cada medição.
• Será registada a média de três leituras, incluindo os valores médios de PAS, PAD e PAM.

• Os kits Duoset de Ensaio de Imunoabsorção Enzimática (ELISA) serão utilizados para quantificar biomarcadores sanguíneos, incluindo IL-6, IL-10 e TNFα, e para avaliar a inflamação sistémica e a sua associação com a doença periodontal e a função vascular. Os kits utilizam uma abordagem de ELISA sanduíche, com um anticorpo de captura pré-revestido numa microplaca, seguido da aplicação da amostra.
• Este método permite a medição precisa de citocinas e proteínas de fase aguda a partir de amostras de sangue dos participantes. A elevada especificidade e sensibilidade permitem a deteção de marcadores pró-inflamatórios (IL-6, TNFα) e anti-inflamatórios (IL-10). Os resultados fornecerão informações sobre a resposta inflamatória e a sua modulação antes e após o tratamento PMPR.

Para avaliar e aferir a eficácia da Remoção Mecânica da Placa Periodontal (RMPP) combinada com um elixir bucal de 0,2% de CHX no Sangramento à Sondagem (SAS)

• O SAS será registado em seis locais por dente como: 0 (mínimo) = sem sangramento, 1 (máximo) = sangramento à sondagem.
• As pontuações serão expressas como a percentagem de locais com sangramento por participante, com um intervalo de mínimo a máximo (0-100%).
• Pontuações mais baixas indicam um melhor resultado periodontal; uma redução reflete melhoria após RMPP ± elixir bucal de CHX.
• Este resultado avaliará a eficácia clínica a curto prazo do elixir bucal de CHX adjuvante à RMPP em indivíduos com doença periodontal.

Para avaliar e aferir a eficácia da Remoção Mecânica da Placa Periodontal (PMPR) combinada com elixir bucal de CHX a 0,2% na Profundidade de Sondagem da Bolsa Periodontal (PPD)

• A PPD será medida em milímetros em seis locais por dente e categorizada como: 0 (mínimo) = ≤3 mm, 1 = 4-5 mm, 2 (máximo) = ≥6 mm. Pontuações mais baixas indicam um melhor resultado periodontal. - A eficácia será avaliada como a variação média na PPD (mm) e como percentagem de fecho da bolsa, definida como locais com PPD basal ≥4 mm que reduzem para ≤3 mm no seguimento.
• Este resultado avaliará a eficácia clínica a curto prazo do elixir bucal de CHX como adjuvante à PMPR em indivíduos com doença periodontal.

Avaliar e aferir a eficácia da Remoção Mecânica de Placa Periodontal (RMPP) combinada com um elixir bucal de 0,2% de CHX no Nível de Inserção Clínica (NIC)

• O Nível de Inserção Clínica (NIC) será calculado combinando as medições da profundidade de sondagem da bolsa e da recessão gengival.
• O NIC será medido em milímetros em seis locais por dente e categorizado como: 0 (mínimo) = 0-2 mm, 1 = 3-4 mm, 2 (máximo) = ≥5 mm.
• A alteração média no NIC (mm) será então comparada entre os dois grupos (RMPP + CHX vs. RMPP + placebo).
• Pontuações mais baixas indicam um melhor resultado periodontal; uma redução reflete um ganho de inserção após o uso de RMPP ± elixir bucal de CHX.
• Este índice será utilizado para avaliar a eficácia clínica a curto prazo do elixir bucal de CHX, como adjuvante à RMPP, em indivíduos com doença periodontal.

Para avaliar e aferir a eficácia da Remoção Mecânica da Placa Periodontal (PMPR) combinada com colutório de 0,2% CHX no índice de placa (PI).

• Será utilizado um score de 0,1,2,3,4,5 para registar o IP nas superfícies vestibulares e linguais dos dentes (exceto terceiros molares) usando os critérios de pontuação modificados de Turesky.
• Sistema de pontuação:
• 0 (mínimo)= Sem placa; 1 = manchas na margem cervical; 2 = banda fina ≤1 mm; 3 = banda >1 mm cobrindo <⅓ da superfície; 4 = placa cobrindo ≥⅓-<⅔; 5 (máximo)= placa cobrindo ≥⅔ da superfície.
• Os scores serão calculados como média de todas as superfícies para obter um score médio de IP de mínimo a máximo, com uma amplitude de 0-5.
• Scores mais baixos indicam melhor higiene oral; uma redução reflete melhoria após PMPR ± colutório CHX.
• Este índice será utilizado para avaliar a eficácia clínica a curto prazo do colutório CHX, como adjuvante ao PMPR, em indivíduos com doença periodontal.

Avaliar e determinar a eficácia da Remoção Mecânica da Placa Periodontal (PMPR) combinada com elixir bucal de CHX a 0,2% no Índice Gengival (GI) de Löe & Silness.

• O GI será avaliado em quatro locais por dente (mesial, distal, vestibular, lingual) e pontuado (num mínimo de 0 a um máximo de 3) com: 0 = normal, 1 = inflamação ligeira, 2 = inflamação moderada, 3 = inflamação grave. As pontuações serão calculadas em média em todos os locais para obter uma pontuação média de GI (intervalo 0-3). Pontuações mais baixas indicam melhor saúde gengival; uma redução reflete uma melhoria após PMPR ± elixir bucal de CHX a 0,2%.
• Classificação da gravidade da gengivite:
• Gengivite ligeira: 0,1-1,0; Gengivite moderada: 1,1-2,0; Grave: 2,1-3,0
• Este índice será utilizado para avaliar a eficácia clínica a curto prazo do elixir bucal de CHX no GI, adjuvante à PMPR, em indivíduos com doença periodontal.