Comparação da Concordância Molecular-Genética do Tumor Primário e das Metástases Cerebrais dos Cancers Gastroesofágicos (GENCONCOR-2)

Os cancros do esófago, da junção gastroesofágica e do estômago, designados coletivamente como cancros gastroesofágicos, representam uma proporção substancial da incidência e mortalidade por cancro a nível global. O desenvolvimento de metástases cerebrais (MC) nestes doentes, outrora considerado um evento extremamente raro com incidências estimadas em menos de 1-2% nas primeiras séries de casos, é agora reconhecido com frequência crescente. Esta frequência crescente é em grande parte atribuída aos avanços na terapia sistémica, que levaram a um melhor controlo da doença extracraniana e a uma sobrevivência prolongada dos doentes, bem como a melhorias na neuroimagem, que aumentaram a deteção de lesões anteriormente assintomáticas, revelando assim o cérebro como um local de santuário comum para a disseminação metastática.

Apesar deste reconhecimento crescente, o panorama molecular e genético das MC provenientes de cancros gastroesofágicos permanece criticamente pouco estudado, com dados limitados sobre biomarcadores preditivos-chave, como HER2, MSI, PD-L1 e CLDN18.2, em amostras emparelhadas primárias e metastáticas. No entanto, o prognóstico para doentes com metástases cerebrais de cancro gastroesofágico não melhorou nas últimas décadas, com a sobrevivência mediana ainda medida em meses.

Para colmatar esta lacuna crítica de conhecimento, iniciámos previamente o estudo internacional GASTROBRAIN (ClinicalTrials.gov ID: NCT07448493), que estabeleceu uma grande coorte retrospetiva multi-institucional de mais de 230 doentes com metástases cerebrais de cancro gástrico e esofágico, com dados clínico-patológicos e de tratamento abrangentes. Como passo seguinte, identificámos, recolhemos e centralizámos sistematicamente material histológico arquivado de doentes com amostras de tecido emparelhadas disponíveis, fixadas em formol e incluídas em parafina (FFPE), do tumor primário e da MC correspondente, para o estudo translacional GENCONCOR-2. Este desenho aninhado permitirá uma investigação robusta da concordância do estado de HER2, MSI, PD-L1 (CPS) e CLDN18.2 em pares tumorais emparelhados - uma análise que, tanto quanto sabemos, não foi previamente reportada.

Avaliação de Biomarcadores

1. O estado HER2 será avaliado por imuno-histoquímica (IHQ) utilizando o clone de anticorpo SP3 (DAKO) na plataforma Ventana GX com o sistema de deteção Ventana OptiView. Os resultados serão avaliados de acordo com as diretrizes ASCO-CAP. Para amostras de adenocarcinoma gástrico, gastroesofágico e esofágico, a pontuação IHQ HER2 seguirá os critérios modificados estabelecidos para cancros do trato gastrointestinal superior. Para espécimes cirúrgicos, a positividade 3+ é definida como coloração membranosa completa, basolateral ou lateral forte em ≥ 10% das células tumorais; para espécimes de biópsia, a coloração membranosa forte num aglomerado de pelo menos 5 células tumorais é considerada positiva, independentemente da percentagem de células tumorais coradas. Casos com IHQ 2+ (coloração membranosa completa, basolateral ou lateral fraca a moderada em ≥ 10% das células tumorais para espécimes cirúrgicos, ou num aglomerado de células tumorais para biópsias) serão considerados equívocos e serão submetidos a avaliação do número de cópias do gene HER2 por hibridização in situ (HIS), incluindo FISH, CISH ou SISH. A positividade HER2 por HIS será definida como uma razão HER2/CEP17 ≥ 2,0; ou, se a razão for < 2,0, um número médio de cópias do gene HER2 ≥ 6,0 sinais por célula. Casos com IHQ 2+ e uma razão HER2/CEP17 < 2,0 com um número médio de cópias do gene HER2 entre ≥ 4,0 e < 6,0 sinais por célula serão considerados indeterminados. Nestes casos indeterminados, será consultado um segundo revisor, e poderá ser considerada a repetição do teste em material tumoral adicional.
2. O estado PD-L1 será avaliado por IHQ utilizando o clone de anticorpo DAKO 22C3 na plataforma Dako Link48 com o sistema de deteção Dako EnVision Flex. O controlo positivo externo será tecido de amígdala. Os resultados serão avaliados de acordo com as recomendações do fabricante do sistema de teste. A expressão PD-L1 será reportada como o Combined Positive Score (CPS), definido como o número de células coradas para PD-L1 (células tumorais, linfócitos, macrófagos) dividido pelo número total de células tumorais viáveis, multiplicado por 100.
3. O estado MSI será determinado por IHQ ou PCR. Para avaliação por IHQ, será avaliada a perda de expressão das proteínas de reparação de erros de emparelhamento (MLH1, MSH2, MSH6, PMS2). Para análise baseada em PCR, a instabilidade de microssatélites será avaliada utilizando cinco marcadores de repetição mononucleotídica (BAT25, BAT26, NR21, NR24, NR27).
4. A expressão CLDN18.2 será avaliada por IHQ utilizando o ensaio VENTANA CLDN18 (43-14A) na plataforma Ventana. A expressão positiva será definida como coloração membranosa completa, basolateral ou lateral moderada a forte (2+/3+) em ≥ 75% das células tumorais viáveis, de acordo com os critérios estabelecidos em ensaios clínicos e diretrizes clínicas atuais. Este limiar será aplicado uniformemente a todas as amostras, incluindo tanto tumores primários como metástases cerebrais, de doentes com adenocarcinomas gástricos, da junção gastroesofágica e esofágicos.
5. Se houver financiamento disponível, será realizada sequenciação de nova geração (NGS) exploratória em amostras tumorais emparelhadas para identificar alterações genómicas adicionais e investigar a sua concordância entre tumores primários e metástases cerebrais.

O objetivo primário deste estudo é avaliar, numa grande coorte do mundo real, a taxa global de discordância molecular (%) entre cancros gastroesofágicos primários e as suas metástases cerebrais emparelhadas - definida como a proporção de casos com estado de biomarcador discordante em relação ao número total de amostras emparelhadas analisadas. Além da taxa global de discordância, a taxa de discordância (%) será analisada separadamente para cada biomarcador (HER2, MSI, PD-L1 (CPS) e CLDN18.2). Os objetivos secundários incluem:

1. Sobrevivência Global (OS): Definida como o tempo desde a data do diagnóstico de metástase cerebral (MC) até à data de morte por qualquer causa ou último seguimento (censurado).

2. Tempo até Progressão Intracraniana (TTIP): Definido como o tempo desde a data do diagnóstico inicial de cancro gástrico e esofágico até à data da primeira deteção de MC. Com base neste intervalo, os doentes serão categorizados em dois grupos:

   • MC Síncronas: MC diagnosticadas antes ou dentro de 2 meses (≤ 60 dias) do diagnóstico do tumor primário.
   • MC Metacrónicas: MC diagnosticadas mais de 2 meses (> 60 dias) após o diagnóstico do tumor primário.

3. Sobrevivência Livre de Progressão do Sistema Nervoso Central (CNS-PFS): Definida como o tempo desde a data do primeiro tratamento local para MC até à data de progressão intracraniana subsequente ou último seguimento instrumental (censurado). A progressão intracraniana subsequente inclui:

   • Crescimento contínuo da lesão tratada (≤ 6 meses após o tratamento);
   • Recorrência local da lesão tratada (> 6 meses após o tratamento);
   • Desenvolvimento de novas lesões intracranianas distantes. Objetivo exploratório: Sujeito à disponibilidade de financiamento, será realizada sequenciação de nova geração (NGS) em amostras emparelhadas para explorar a concordância de um painel mais amplo de alterações genómicas entre tumores primários e as suas metástases cerebrais emparelhadas.

Análise Estatística. Todas as análises estatísticas serão realizadas utilizando IBM SPSS Statistics (versão 29.0) e STATA (versão 17.0, StataCorp LLC). Um valor p bilateral < 0,05 será considerado estatisticamente significativo.

• Estatística Descritiva. As variáveis categóricas serão apresentadas como frequências absolutas (n) e frequências relativas (%). As variáveis contínuas serão avaliadas quanto à normalidade. Variáveis com distribuição normal serão apresentadas como média com desvio padrão (DP); variáveis sem distribuição normal serão apresentadas como mediana com intervalo interquartil (IIQ). A frequência de dados em falta será reportada para todas as variáveis.
• Análise de Discordância e Concordância. O objetivo primário é a taxa global de discordância molecular (%) - definida como a proporção de casos com estado de biomarcador discordante entre o tumor primário e a sua metástase cerebral emparelhada em relação ao número total de amostras emparelhadas analisadas. Além da taxa global de discordância, a taxa de discordância (%) será analisada separadamente para cada biomarcador (HER2, MSI, PD-L1 (CPS) e CLDN18.2). Além disso, a concordância será avaliada utilizando o percentual de concordância global e o coeficiente kappa de Cohen (κ) com intervalos de confiança de 95%. Os valores de kappa serão interpretados da seguinte forma: ≤ 0 = concordância fraca, 0,01-0,20 = concordância ligeira, 0,21-0,40 = concordância razoável, 0,41-0,60 = concordância moderada, 0,61-0,80 = concordância substancial, e 0,81-1,00 = concordância quase perfeita.
• Análise de Sobrevivência. As curvas de sobrevivência serão estimadas utilizando o método de Kaplan-Meier. Os tempos de sobrevivência mediana com intervalos de confiança de 95% (IC) serão reportados. A comparação das curvas de sobrevivência entre grupos (por exemplo, casos concordantes vs. discordantes, biomarcador-positivo vs. biomarcador-negativo) será realizada utilizando o teste de log-rank.
• Análise Univariável e Multivariável. Será realizada regressão de Cox proporcional de riscos univariável para identificar potenciais fatores prognósticos associados aos resultados de sobrevivência (OS, CNS-PFS). Variáveis com p < 0,10 na análise univariável, bem como fatores clinicamente relevantes independentemente da significância, serão incluídas em modelos de regressão de Cox proporcional de riscos multivariável para identificar fatores prognósticos independentes. A suposição de riscos proporcionais será testada. Os resultados serão apresentados como rácios de risco (HR) com IC de 95%.
• Associação com Dados Clínico-Patológicos. O estado do biomarcador e os padrões de discordância serão correlacionados com variáveis clínico-patológicas e modalidades de tratamento utilizando o teste qui-quadrado ou o teste exato de Fisher para variáveis categóricas, e o teste t ou o teste U de Mann-Whitney para variáveis contínuas, conforme apropriado. Estas análises aproveitarão o conjunto de dados clínico-patológicos abrangente estabelecido na coorte parental GASTROBRAIN.
• Tratamento de Dados em Falta. A proporção de dados em falta será reportada para todas as variáveis. Os padrões de dados em falta serão explorados. Dada a natureza acessória deste estudo translacional, apenas casos com dados de biomarcadores emparelhados completos serão incluídos nesta análise.