Medicina de Precisão para Sng/Controle da Dor (SNG)

A dor é definida como "uma experiência sensorial e emocional desagradável associada a dano tecidual real ou potencial ou descrita em termos de tal dano" pela Associação Internacional para o Estudo da Dor (IASP). Os distúrbios músculo-esqueléticos não são apenas a causa mais comum de feridas/dor crônica, mas também resultam em incapacidade significativa em cerca de 50% dos pacientes nos EUA. Além disso, uma vez que esses distúrbios são a causa mais comum de dor severa e de longo prazo e incapacidade em idosos com mais de 65 anos. Na prática da medicina da dor, os médicos usam predominantemente tratamento multimodal, incluindo medicamentos, agentes físicos e injeção, para aliviar o desconforto dos pacientes.

Nos últimos anos, nossa equipe teve algumas conquistas que justificam a busca de variantes genéticas para o desenvolvimento de um novo algoritmo de tratamento de feridas/dor.

(1) A analgesia da LLLT é por TRPV1. (2) A analgesia por ultrassom terapêutico é através do ASIC3. (3) A injeção de dextrose diminuiu a dor muscular crônica por meio de ASIC1a. (4) Biomarcador para ferida/dor na fibromialgia.

De acordo com o resultado clínico, alguns pacientes responderam bem aos agentes físicos e alguns preferiram injeções. As variantes genéticas dos genes acima mencionados podem ser os fatores determinantes dos efeitos terapêuticos diferenciais. No entanto, demorou cerca de 4-8 semanas para um paciente mudar de uma opção de tratamento para outra. Se os investigadores puderem determinar a modalidade de tratamento ideal por biomarcadores genéticos, o curso do tratamento e a extensão total diminuirão muito.

Os investigadores levantam a hipótese de que as variantes genéticas dos genes propostos (TRPV1, ASIC1a, ASIC3, Tac1, COMT, TCL1A, POMC, RGS4, ASIC2, ASIC4, TRPA1, NK1R, G2A, GPR4, OGR1, TDAG8, TASK1, TASK2, TASK3, TREK1 , P2X2, P2X3, P2X5, TRPV4, KCNK1, NTSR1, NTSR2) podem ser os biomarcadores prognósticos de tratamentos de feridas/dor. Nossos Objetivos específicos são:

1. Para configurar a abordagem baseada em sequenciamento de próxima geração (NGS) para encontrar variantes genéticas que podem determinar a resposta das modalidades de tratamento de feridas/dor.
2. Encontrar possíveis marcadores metabolômicos e proteômicos de feridas/dor.
3. Determinar o algoritmo da medicina de precisão para controle de feridas/dor por meio de marcadores genéticos.

Seis. desenho do estudo I Elegibilidade do paciente Os investigadores irão recrutar pacientes da National Taiwan University Hospital Bei-Hu Branch.

Critérios de inclusão: (1) Idade entre 20-100 anos. (2) Diagnosticados como pacientes com síndrome de dor miofascial e dispostos a receber tratamento (incluindo LLLT, ultrassom terapêutico e terapia de injeção local de dextrose). O diagnóstico de MPS foi confirmado pelo investigador principal usando os critérios de banda tensa, ponto de gatilho e dor irradiada.

Critérios de exclusão: Foram excluídos aqueles com infecção ativa, malignidade e doenças hematológicas. Os pacientes que receberam injeção local no trapézio superior dentro de 3 meses também são excluídos.

II Desenho e fluxo do estudo

1. Depois de obter o consentimento informado, são coletados os dados demográficos básicos, incluindo idade, sexo, trabalho, nível educacional e histórico médico dos pacientes elegíveis.
2. Os pacientes elegíveis receberam primeiro LLLT com um comprimento de onda de 685 nm e uma saída de 30 mW em densidades de energia de 8 J/cm2 no ponto de gatilho do músculo trapézio superior. O pré e pós-tratamento VAS-dor e VAS-sng são coletados para determinação do fenótipo LLLT, respectivamente.
3. Em seguida, são divididos aleatoriamente em dois grupos (40 indivíduos em cada grupo): A. grupo ultrassom terapêutico; B. grupo de proloterapia. O grupo A recebe ultrassom terapêutico de 1 MHz por 5 minutos a uma frequência de 2 a 3 vezes por semana no músculo trapézio superior doloroso. Grupo B recebe proloterapia hipertônica no perimísio do músculo trapézio superior. O injetável é 5ml de solução de dextrose a 5%. Para garantir que a agulha não estava em um vaso sanguíneo, a agulha foi aspirada antes da injeção. O mesmo médico (o investigador principal) injeta todos os pacientes para evitar variabilidade entre médicos. Nenhuma outra medicação ou modalidade física foi administrada para evitar interferência na eficácia em ambos os grupos.
4. Os pacientes recrutados recebem avaliação antes e depois da injeção e 2 semanas após a injeção. O desfecho primário é VAS-dor e VAS-ferida (escala visual analógica) com uma pontuação de 0-100, onde 100 é o valor que representa o maior grau de dor. Os desfechos secundários são limiar de dor, tônus ​​muscular e SF-36 - um questionário composto por 36 itens e 8 domínios que abordam a percepção do paciente sobre sua QV. Amostras de sangue venoso e urina foram coletadas na primeira visita e na visita de 2 semanas, respectivamente. As amostras de sangue foram rotuladas com um número de identificação anonimizado, centrifugadas e armazenadas a -80 ºC em freezer trancado até o momento do processamento futuro. A camada leucocitária é separada após a centrifugação e também armazenada. As amostras de urina foram aliquotadas e armazenadas a -80 ºC em freezer trancado para análises futuras.
5. Terapia de resgate (tratamento cruzado): Se o participante não ficar satisfeito com a primeira rodada de tratamento e a melhora do VAS for inferior a 1,0, ele será elegível para receber a terapia de resgate - o tratamento do outro grupo. E eles retornarão à clínica por mais 2 semanas. As variáveis ​​de resultado também serão coletadas na 3ª visita.

(1) Extração de DNA e sequenciamento baseado em NGS e genotipagem O DNA genômico será extraído de células mononucleares do sangue periférico dos participantes usando o kit Gentra Puregene seguindo o protocolo do fabricante e submetido a gel de agarose e O.D. testes de proporção para confirmar sua pureza e concentração. O DNA será fragmentado usando Covaris, visando o comprimento de pico de 800 pb. As bibliotecas Illumina serão geradas a partir do gDNA usando o kit de preparação da biblioteca TruSeq.

As sondas de captura de DNA serão projetadas de forma personalizada para atingir TRPV1, ASIC1a, ASIC3, Tac1, COMT, TCL1A, POMC, RGS4, ASIC2, ASIC4, TRPA1, NK1R, G2A, GPR4, OGR1, TDAG8, TASK1, TASK2, TASK3, TREK1, P2X2, P2X3, P2X5, TRPV4, KCNK1, NTSR1, NTSR2 e serão sintetizados usando o protocolo Roche KAPA HyperChoice. Todas as regiões codificantes e não codificantes (promotoras, íntrons, regiões não traduzidas 5' e 3') desses 8 genes serão incluídas.

O enriquecimento da região alvo NGS será aplicado para enriquecer/capturar a região alvo (~148 Kb). As bibliotecas enriquecidas serão sequenciadas usando o Illumina MiSeq para gerar leituras pareadas de 300 pb. A profundidade esperada das regiões segmentadas será de 200x em média.

(2) Análise metabolômica e proteômica

1. Resumidamente, as análises de LC-MS de urina e soro envolveram o uso de um sistema Agilent 1290 UPLC (coluna ACQUITY UPLC HSS T3, 2,1 × 100 mm; 1,8 µm; Waters, Milford, MA, EUA) acoplado ao 6540-Quadrupole-Time- sistema de massa de voo (QTOF) (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EUA). Os arquivos brutos do MS foram convertidos para o formato mzXML usando o Trapper (ISB) e processados ​​pelo TIPick, um pacote interno. Após o processamento TIPick, a normalização baseada em escala foi realizada de acordo com as abundâncias totais de íons de cada conjunto de dados UHPLC-MS.
2. O perfil lipidômico LC-MS foi realizado e descrito em detalhes. Concisamente, o perfil lipidômico foi executado em um ZORBAX Eclipse Plus C18 (2,1 x 100 mm, 1,8 µm, Agilent Technologies, Waldbronn, Alemanha) para QTOF, bem como a fase móvel A consistia em 0,1% de ácido fórmico aquoso e 10 mM de acetato de amônio e a fase móvel B consistia em ácido fórmico a 0,1% e acetato de amônio 10 mM em ACN/álcool isopropílico (50/50). O amostrador automático e o forno da coluna foram mantidos a 4°C e 55°C, respectivamente. O volume de injeção foi de 5 μl. A aquisição de MS foi executada no modo de varredura de íons precursores (PIS) e no modo de monitoramento de reações múltiplas (MRM).
3. Todos os dados brutos UPLC-MS foram convertidos para o formato mzXML usando Trapper (ISB) e normalizados pelo TIPick, um pacote interno, bem como aumento de pico e pico escolhido para os metabólitos direcionados. Um banco de dados interno de esfingomielinas (SM), lisofosfatidilcolina (LysoPC), ceramidas (Cer), fosfatidilcolinas (PCs), fosfatidilinositol (PI), fosfatidiletanolamina (PE) e cerebrosídeo (CB) no Laboratório Central de Metabolômica, Centro de Genômica Medicine, National Taiwan University, foi usado para triagem.