Прецизионная медицина для Sng / контроля боли (SNG)

Боль определяется Международной ассоциацией по изучению боли (IASP) как «неприятное сенсорное и эмоциональное переживание, связанное с фактическим или потенциальным повреждением тканей или описываемое с точки зрения такого повреждения». Заболевания опорно-двигательного аппарата являются не только наиболее распространенной причиной хронических воспалений/болей, но и приводят к значительной инвалидности примерно у 50% больных в США. Кроме того, поскольку эти расстройства являются наиболее частой причиной сильной, длительной боли и инвалидности у пожилых людей старше 65 лет. В практике медицины боли врачи преимущественно используют мультимодальное лечение, включающее лекарства, физические агенты и инъекции, для облегчения дискомфорта пациентов.

В последние годы у нашей команды были некоторые достижения, чтобы оправдать поиск генетических вариантов для разработки нового алгоритма лечения раны/боли.

(1) Обезболивание LLLT осуществляется через TRPV1. (2) Обезболивание терапевтическим ультразвуком осуществляется через ASIC3. (3) Инъекция декстрозы уменьшала хроническую мышечную боль с помощью ASIC1a. (4) Биомаркер язвы/боли при фибромиалгии.

Судя по клиническим результатам, некоторые пациенты хорошо реагировали на физические агенты, а некоторые предпочитали инъекции. Генетические варианты вышеуказанных генов могут быть определяющими факторами дифференциального терапевтического эффекта. Однако пациенту требовалось около 4-8 недель для перехода с одного варианта лечения на другой. Если исследователи смогут определить оптимальный метод лечения с помощью генетических биомаркеров, курс лечения и общий объем лечения значительно сократятся.

Исследователи предполагают, что генетические варианты предложенных генов (TRPV1, ASIC1a, ASIC3, Tac1, COMT, TCL1A, POMC, RGS4, ASIC2, ASIC4, TRPA1, NK1R, G2A, GPR4, OGR1, TDAG8, TASK1, TASK2, TASK3, TREK1 , P2X2, P2X3, P2X5, TRPV4, KCNK1, NTSR1, NTSR2) могут быть прогностическими биомаркерами лечения раны/боли. Нашими конкретными целями являются:

1. Разработать подход, основанный на секвенировании следующего поколения (NGS), для поиска генетических вариантов, которые могут определять реакцию на методы лечения язвы/боли.
2. Найти возможные метаболомные и протеомные маркеры болезненности/боли.
3. Определить алгоритм прецизионной медицины для контроля боли с помощью генетических маркеров.

Шесть. Дизайн исследования I Соответствие требованиям пациентов Исследователи будут набирать пациентов из отделения больницы Бэй-Ху при Национальном тайваньском университете.

Критерии включения: (1) Возраст от 20 до 100 лет. (2) Пациенты с миофасциальным болевым синдромом, желающие получить лечение (включая НИЛИ, терапевтическое ультразвуковое исследование и терапию местными инъекциями декстрозы). Диагноз МПС был подтвержден Главным исследователем с использованием критериев натяжения тяжа, триггерной точки и иррадиирующей боли.

Критерии исключения: были исключены пациенты с активной инфекцией, злокачественными новообразованиями и гематологическими заболеваниями. Также исключаются пациенты, которым в течение 3 мес вводили локальную инъекцию в верхнюю часть трапециевидной мышцы.

II Дизайн и ход исследования

1. После получения информированного согласия собираются основные демографические данные, включая возраст, пол, работу, уровень образования и прошлую историю болезни подходящих пациентов.
2. Подходящим пациентам сначала проводилась НИЛИ с длиной волны 685 нм и выходной мощностью 30 мВт при плотности энергии 8 Дж/см2 в триггерной точке верхней части трапециевидной мышцы. Для определения фенотипа LLLT собирают данные VAS-боль и VAS-sng до и после лечения соответственно.
3. Затем их случайным образом распределяют на две группы (по 40 человек в каждой): A. группа лечебного ультразвука; B. Группа пролотерапии. Группа А получает лечебный ультразвук 1 МГц в течение 5 мин с частотой 2-3 раза в неделю на болезненный верхний отдел трапециевидной мышцы. Группа В получает гипертоническую пролотерапию перимизия верхней части трапециевидной мышцы. Инъекционное средство – 5 мл 5% раствора декстрозы. Чтобы убедиться, что игла не попала в кровеносный сосуд, иглу перед инъекцией аспирировали. Один и тот же врач (главный исследователь) вводит инъекции всем пациентам, чтобы избежать различий между врачами. Никаких других лекарств или физических упражнений не назначалось, чтобы избежать влияния на эффективность в обеих группах.
4. Набранных пациентов оценивают до и после инъекции, а также через 2 недели после инъекции. Первичным результатом является ВАШ-боль и ВАШ-боль (визуальная аналоговая шкала) с оценкой от 0 до 100, где 100 — это значение, представляющее наивысшую степень боли. Вторичными результатами являются болевой порог, мышечный тонус и опросник SF-36-a, состоящий из 36 пунктов и 8 доменов, касающихся восприятия пациентом своего качества жизни. Образцы венозной крови и мочи были собраны при первом посещении и через 2 недели соответственно. Образцы крови были помечены анонимным идентификационным номером, центрифугированы и хранились при температуре -80 ºC в закрытой морозильной камере до момента будущей обработки. Лейкоцитарная пленка отделяется после центрифугирования и также хранится. Образцы мочи разделяли на аликвоты и хранили при температуре -80 ºC в закрытой морозильной камере для последующего анализа.
5. Спасательная терапия (перекрестное лечение): если участник не удовлетворен своим лечением в первом раунде и улучшение по ВАШ меньше 1,0, то он имеет право на получение спасательной терапии — лечения в другой группе. И они вернутся в клинику еще на 2 недели. Переменные исхода также будут собраны во время 3-го визита.

(1) Экстракция ДНК, секвенирование и генотипирование на основе NGS Геномная ДНК будет извлечена из мононуклеарных клеток периферической крови участников с использованием набора Gentra Puregen в соответствии с протоколом производителя и подвергнута обработке в агарозном геле и O.D. тесты соотношения для подтверждения его чистоты и концентрации. ДНК будет фрагментирована с использованием Covaris с целью достижения длины пика 800 п.н. Библиотеки Illumina будут созданы из гДНК с использованием набора для подготовки библиотек TruSeq.

Зонды захвата ДНК будут специально разработаны для нацеливания на TRPV1, ASIC1a, ASIC3, Tac1, COMT, TCL1A, POMC, RGS4, ASIC2, ASIC4, TRPA1, NK1R, G2A, GPR4, OGR1, TDAG8, TASK1, TASK2, TASK3, TREK1, P2X2, P2X3, P2X5, TRPV4, KCNK1, NTSR1, NTSR2 и будут синтезированы с использованием протокола Roche KAPA HyperChoice. Будут включены все кодирующие и некодирующие области (промоторы, интроны, 5'- и 3'-нетранслируемые области) этих 8 генов.

Обогащение целевой области NGS будет применяться для обогащения/захвата целевой области (~ 148 КБ). Обогащенные библиотеки затем будут секвенированы с использованием Illumina MiSeq для получения парных чтений длиной 300 п.н. Ожидаемая глубина целевых регионов будет в среднем 200x.

(2) Метаболический и протеомный анализ

1. Вкратце, ЖХ-МС анализы мочи и сыворотки проводились с использованием системы UPLC Agilent 1290 (колонка ACQUITY UPLC HSS T3, 2,1×100 мм; 1,8 мкм; Waters, Милфорд, Массачусетс, США) в сочетании с 6540-Quadrupole-Time- система масс полета (QTOF) (Agilent Technologies, Санта-Клара, Калифорния, США). Необработанные файлы MS были преобразованы в формат mzXML с помощью Trapper (ISB) и обработаны собственным пакетом TIPick. После обработки TIPick была выполнена нормализация на основе масштабирования в соответствии с общим содержанием ионов из каждого набора данных УВЭЖХ-МС.
2. Было проведено и подробно описано липидомное профилирование ЖХ-МС. Вкратце, липидомное профилирование выполняли на ZORBAX Eclipse Plus C18 (2,1 x 100 мм, 1,8 мкм, Agilent Technologies, Вальдброн, Германия) для QTOF, а подвижная фаза А состояла из 0,1% водного раствора муравьиной кислоты и 10 мМ ацетата аммония и подвижная фаза В состояла из 0,1% муравьиной кислоты и 10 мМ ацетата аммония в смеси ACN/изопропиловый спирт (50/50). Автоматический пробоотборник и термостат колонки поддерживали при 4°C и 55°C соответственно. Объем инъекции составлял 5 мкл. Получение МС было выполнено в режиме сканирования ионов-предшественников (PIS) и в режиме мониторинга множественных реакций (MRM).
3. Все необработанные данные UPLC-MS были преобразованы в формат mzXML с помощью Trapper (ISB) и нормализованы с помощью TIPick, собственного пакета, а также с усилением пиков и пиками, выбранными для целевых метаболитов. Собственная база данных сфингомиелинов (SM), лизофосфатидилхолина (LysoPC), церамидов (Cer), фосфатидилхолинов (PC), фосфатидилинозитола (PI), фосфатидилэтаноламина (PE) и цереброзида (CB) в основной лаборатории метаболомики, Центр геномики. Медицина Национального Тайваньского университета была использована для скрининга.