Разработка иммунологических анализов человека, специфичных для вируса папилломы человека типа 16 E7, у человека, не относящегося к HLA2-типу

ВПЧ и рак шейки матки Вирусы папилломы человека (ВПЧ) представляют собой небольшие ДНК-вирусы без оболочки, вызывающие эпителиальные опухоли кожи или слизистых оболочек. Большинство опухолей доброкачественные, имеют ограниченный рост и обычно спонтанно регрессируют. Однако ряд вирусов папилломы человека вызывают опухоли, которые в конечном итоге могут прогрессировать в карциному. Генитальные типы ВПЧ 16 и 18, реже типы 31, 33, 35, 45, 51 и 56, вовлечены в этиологию рака шейки матки и других аногенитальных видов рака. Приблизительно у 500 000 женщин во всем мире ежегодно развивается рак шейки матки, и он является второй по значимости причиной смерти от рака среди женщин [1]. В развитых странах рак шейки матки уступает раку молочной железы, легких, матки и яичников и составляет 7% всех онкологических заболеваний у женщин. В США ежегодно от рака шейки матки умирает около 4800 человек [2]. Доказательства связи ВПЧ с аногенитальным раком получены из эпидемиологических и лабораторных исследований. Более 90% случаев рака шейки матки и их предшественников, так называемой цервикальной интраэпителиальной неоплазии (CIN), содержат последовательности ДНК вируса папилломы человека (ВПЧ) [3]. Типы ВПЧ, обнаруженные в раковых клетках, обладают трансформирующей активностью в исследованиях in vitro [4], а вирусные трансформирующие белки, Е6 и Е7, последовательно экспрессируются в клеточных линиях рака шейки матки [5] и в раке, ассоциированном с ВПЧ [6]. При злокачественной трансформации, связанной с ВПЧ, вирусная ДНК может быть интегрирована в клеточную ДНК, и интеграция часто приводит к удалению больших участков вирусного генома. Поздние гены (L1 и L2) и некоторые ранние гены (E1 и E2) обычно теряются, в результате чего E6 и E7 остаются единственными открытыми рамками считывания, часто встречающимися в карциномах. Экспрессия E6 и E7, вероятно, преодолевает регуляцию клеточной пролиферации, обычно опосредованную такими белками, как p53 и Rb, обеспечивая неконтролируемый рост и обеспечивая возможность злокачественной трансформации [7].

Онкогенные белки ВПЧ, Е6 и Е7, как идеальные мишени для разработки антиген-специфической иммунотерапии или вакцин против ВПЧ-ассоциированных злокачественных новообразований шейки матки. Во-первых, более 90% случаев рака шейки матки связаны с ВПЧ, особенно типа 16, а E6 и E7 постоянно экспрессируются при большинстве случаев рака шейки матки. Во-вторых, в то время как большинство опухолеспецифических антигенов происходят из нормальных белков или мутантных белков, Е6 и Е7 являются полностью чужеродными вирусными белками и потенциально могут содержать больше антигенных пептидов/эпитопов, чем мутантный белок (т. p53) или реактивированный эмбриональный белок (т.е. МАГЭ-1). В-третьих, поскольку Е6 и Е7 необходимы для индукции и поддержания злокачественного фенотипа раковых клеток [8], клетки рака шейки матки не могут уклониться от иммунного ответа за счет потери антигена. Без функциональных E6 и E7 эти клетки перестали бы быть туморогенными. Таким образом, белки Е6 и Е7 представляют собой идеальные мишени для разработки антиген-специфической иммунотерапии или вакцин против рака шейки матки.

Различные формы вакцин, такие как вакцины на основе векторов, вакцины на основе опухолей, вакцины на основе ДНК и вакцины на основе белков/пептидов, были описаны в экспериментальных системах, нацеленных на белки Е6 и/или Е7 ВПЧ-16 [9, 10]. Например, Менегуцци и др. сообщили, что инокуляция крыс рекомбинантами коровьей оспы, экспрессирующими HPV-16 E6 или E7, замедляла или предотвращала развитие опухоли у 25-47% крыс, зараженных онкогенной клеточной линией крыс, котрансфицированной HPV-16 и активированной ras [9]. Кроме того, Чен и соавт. продемонстрировали, что иммунизация мышей сингенными неопухолевыми клетками, трансфицированными геном HPV-16 E7, обеспечивает защиту от трансплантированных HPV-16 E7 положительных сингенных опухолевых клеток [11]. Фельткамп и др. идентифицировали эпитоп CTL в HPV-16 E7, используя исследования связывания пептидов H-2Kb и H-2Db MHC класса I. Иммунизация этим пептидом делала мышей устойчивыми к заражению опухолевыми клетками, трансформированными ВПЧ-16 [12]. Кроме того, использовались химерные папилломавирусоподобные частицы (CVLP), состоящие из химерных белков HPV-16 L1-E7 (Nieland et al., личное сообщение) или HPV-16 L1/L2-E7 (Greenstone et al., личное сообщение). в качестве терапевтических вакцин против опухолей, экспрессирующих HPV-16 E7, на мышиных моделях. Совсем недавно клинические испытания фазы I/II были проведены у восьми пациентов с поздней стадией рака шейки матки с использованием живого рекомбинантного вируса коровьей оспы, экспрессирующего белки Е6 и Е7 ВПЧ 16 и 18 (ТА-ВПЧ) [13]. В этом исследовании не наблюдалось никаких значительных клинических побочных эффектов или загрязнения окружающей среды живым TA-HPV [13].

Важность клеточно-опосредованного иммунного ответа в борьбе как с ВПЧ-инфекцией, так и с ВПЧ-ассоциированными новообразованиями Несколько линий доказательств указывают на то, что клеточно-опосредованные иммунные ответы важны для контроля как ВПЧ-инфекций, так и ассоциированных с ВПЧ новообразований (для обзора см. [14]). Во-первых, распространенность связанных с ВПЧ заболеваний (инфекций и новообразований) увеличивается у реципиентов трансплантатов [15] и пациентов, инфицированных вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ) [16], о которых известно, что у обоих нарушен клеточно-опосредованный иммунитет. Во-вторых, исследования на животных показали, что иммунизированные животные защищены от папилломавирусной инфекции и от развития неоплазии. Иммунизация также способствует регрессу существующих поражений [17-19]. В-третьих, инфильтрирующие CD4+ (Т-клетки-хелперы) и CD8+ (цитотоксические/супрессорные Т-клетки) Т-клетки наблюдались в спонтанно регрессирующих бородавках [20] и, в-четвертых, бородавки у пациентов, получающих иммуносупрессивную терапию, часто исчезают при прекращении этого лечения (для обзор см. [21].

Клеточный иммунный ответ на ВПЧ. Пониманию опосредованного Т-клетками иммунитета к ВПЧ-инфекциям способствовала идентификация эпитопов MHC класса I и класса II белков ВПЧ. Несколько групп пытались картировать мышиные [22-24] и человеческие [25, 26] эпитопы Т-хелперов (Th) клеток на белках ВПЧ. Несколько групп также попытались картировать эпитопы мышиных [12, 27-30], а также человеческих [31-34] цитотоксических Т-лимфоцитов (CTL) на белках ВПЧ. Каст и др. идентифицировали несколько высокоаффинных связывающих пептидов белков E6 и E7 HPV-16 с аллелями HLA-A человека [32]. Кроме того, в периферической крови больных раком шейки матки [13, 35], у здоровых доноров [33, 36] и у пациентов с поражением ЦИН [34, 37, 38] были продемонстрированы ВПЧ-специфические ЦТЛ, распознающие белки ВПЧ Е6 и Е7. Кроме того, недавно была описана инфильтрация ткани рака шейки матки ВПЧ-специфичными ЦТЛ [39].

Клеточные иммунные ответы при поражениях, инфицированных ВПЧ, могут быть продемонстрированы с помощью кожных тестов in vivo [40, 41], анализов ЦТЛ in vitro [35, 37, 39] и лимфопролиферативного ответа in vitro [25, 26, 42-48]. Например, Hopfl et al. использовали экспрессированные бактериями белки HPV-16 для кожных тестов у пациентов с поражениями CIN и обнаружили специфические реакции кожи на белок вириона L1, а не на белок E4 [40]. У пациентов с поражениями ЦИН в РВМС [35, 37] и в тканях шейки матки были идентифицированы ВПЧ-специфические ЦТЛ [39]. Активно исследуются лимфопролиферативные реакции in vitro у пациентов с поражениями CIN. Например, de Gruijl et al. сообщили, что пролиферативный ответ Т-клеток против онкогенного белка Е7 ВПЧ-16 был наиболее выраженным у пациентов с КИН с персистирующей ВПЧ-инфекцией [45]. Однако Кадиш и соавт. сообщили, что лимфопролиферативные ответы на специфические пептиды Е6 и Е7 ВПЧ-16, по-видимому, связаны с исчезновением ВПЧ-инфекции и регрессом поражений ЦИН [46].

Важность функций хелперных Т-клеток в создании эффективных противоопухолевых ответов Все больше данных свидетельствуют о том, что неадекватные противоопухолевые ответы могут быть результатом недостаточности хелперного ответвления иммунного ответа. События, приводящие к активации ЦТЛ, жестко регулируются, чтобы защитить от развития неадекватных иммунных ответов на собственные антигены или преувеличенных ответов на чужеродные антигены. Эта регуляция опосредована лимфокинами, продуцируемыми CD4+ Т-хелперными клетками. CD4+ Т-хелперные клетки имеют решающее значение для генерации мощного противоопухолевого иммунного ответа. Было показано, что CD4+ Т-клетки играют важную роль в формировании иммунных ответов против нескольких солидных злокачественных новообразований у мышей [49, 50] и у человека [51, 52]. Несколько опухолей мышей, трансфицированных сингенными генами МНС класса II, становятся очень эффективными вакцинами против последующего заражения негативными опухолями дикого типа класса II [53, 54]. Кроме того, как важные клетки памяти в Т-клеточном плече иммунной системы, клетки CD4+ могут обеспечивать длительный иммунитет против специфических антигенов [55, 56].

Роль цитокинов в клеточном иммунитете Клеточный иммунитет регулируется цитокинами, которые секретируются Т-хелперными клетками. В целом Т-хелперные клетки можно классифицировать как клетки Th1 и/или Th2 на основе различных типов секретируемых ими цитокинов. Клетки Th1 секретируют интерлейкин (IL) 2 и гамма-интерферон (IFN-). Клетки Th2 продуцируют ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-10 и ИЛ-13. Th1-лимфоциты являются наиболее важными эффекторными клетками при воспалительных реакциях, связанных с выраженной гиперчувствительностью замедленного типа, но низкой продукцией антител, как это происходит при контактном дерматите и вирусных или внутриклеточных бактериальных инфекциях (см. обзор [57, 58]). Функциональный фенотип большинства клеток Th2 может объяснять как постоянную продукцию определенных изотипов антител, особенно IgG1 и IgE, так и эозинофилию, наблюдаемую при гельминтозах и аллергических заболеваниях человека. Считается, что опосредованная лимфоцитами защита от вирусных инфекций, а также контроль над опухолями опосредованы ответами цитокинов Th1 и нарушены ответами цитокинов Th2. IL-2 и IFN-, вызывающие ответ Th1, вероятно, являются основным компонентом, который способствует развитию клеточно-опосредованного иммунитета против инфекций, вызванных ВПЧ, и новообразований, связанных с ВПЧ.

Химерные E7-специфические вакцины могут контролировать модель опухоли, экспрессирующей HPV16 E7. В сотрудничестве с профессором TC Wu из Медицинского института Джонса Хопкинса мы успешно разработали несколько химерных ДНК-, РНК- и вирус-векторных вакцин для профилактики и лечения HPV16-экспрессирующих E7 опухоль на животной модели [59-61]. Мы обнаружили, что эти E7-химерные ДНК-вакцины способны предотвращать и лечить рост мышиных модельных опухолей, экспрессирующих E7. Эти положительные результаты доклинических моделей на мышах побудили нас сосредоточиться на разработке противораковой вакцины и иммунотерапии и применить эти вакцины на людях.

Тем не менее, очень важно организовать различные специфические для Е7 иммунологические анализы человека для оценки эффекта противораковой вакцины или иммунотерапии в будущих клинических испытаниях. Поэтому мы хотели бы представить это предложение, касающееся разработки иммунологических анализов, специфичных для HPV 16 E7, у человека. Этот проект преследует несколько целей: 1) разработать и использовать анализы для измерения ЦТЛ на белки Е7 ВПЧ 16, 2) разработать и использовать анализы для измерения ответов Т-хелперов (Th) на антигены Е7 ВПЧ 16.