O Desenvolvimento de Ensaios Imunológicos Humanos Específicos para Papilomavírus Humano Tipo 16 E7 em Seres Humanos Não Tipo HLA2

HPV e cânceres cervicais Papilomavírus humano (HPV) são pequenos vírus de DNA não envelopados que induzem tumores epiteliais da pele ou mucosa. A maioria dos tumores é benigna, apresenta crescimento limitado e geralmente regride espontaneamente. No entanto, vários papilomavírus humanos induzem tumores que podem eventualmente progredir para carcinomas. Os tipos genitais de HPV 16 e 18, e menos freqüentemente os tipos 31, 33, 35, 45, 51 e 56, têm sido implicados na etiologia do câncer cervical e outros cânceres anogenitais. Aproximadamente 500.000 mulheres em todo o mundo desenvolvem câncer cervical anualmente e é a segunda principal causa de morte por câncer em mulheres [1]. Nos países desenvolvidos, o câncer do colo do útero está atrás dos cânceres de mama, pulmão, útero e ovários e representa 7% de todos os cânceres femininos. Nos Estados Unidos, ocorrem cerca de 4.800 mortes anualmente por câncer cervical [2]. As evidências que ligam os HPVs ao câncer anogenital vêm de estudos epidemiológicos e laboratoriais. Mais de 90% dos cânceres cervicais e seus precursores, as chamadas neoplasias intraepiteliais cervicais (NIC), contêm sequências de DNA do papilomavírus humano (HPV) [3]. Os tipos de HPV encontrados em células cancerígenas têm atividade transformadora em estudos in vitro [4] e as proteínas virais transformadoras, E6 e E7, são consistentemente expressas em linhas celulares de câncer cervical [5] e em pacientes com cânceres associados ao HPV [6]. Na transformação maligna associada ao HPV, o DNA viral pode ser integrado ao DNA celular e a integração geralmente resulta na deleção de grandes setores do genoma viral. Genes tardios (L1 e L2) e alguns genes precoces (E1 e E2) geralmente são perdidos, deixando E6 e E7 como os únicos quadros de leitura abertos frequentemente encontrados em carcinomas. É provável que a expressão de E6 e E7 supere a regulação da proliferação celular normalmente mediada por proteínas como p53 e Rb, permitindo o crescimento descontrolado e proporcionando o potencial de transformação maligna [7].

Proteínas oncogênicas do HPV, E6 e E7, como alvos ideais para o desenvolvimento de imunoterapias específicas para antígenos ou vacinas para malignidades cervicais associadas ao HPV E6 e E7 representam alvos ideais para o desenvolvimento de imunoterapias específicas para antígenos ou vacinas para malignidades associadas ao HPV. Primeiro, mais de 90% dos cânceres cervicais foram associados a HPVs, particularmente o tipo 16, e E6 e E7 são consistentemente expressos na maioria dos cânceres cervicais. Em segundo lugar, enquanto a maioria dos antígenos específicos do tumor são derivados de proteínas normais ou proteínas mutantes, E6 e E7 são proteínas virais completamente estranhas e potencialmente podem abrigar mais peptídeos/epítopos antigênicos do que uma proteína mutante (ou seja, p53) ou uma proteína embrionária reativada (i.e. MAGE-1). Em terceiro lugar, uma vez que E6 e E7 são necessários para a indução e manutenção do fenótipo maligno das células cancerígenas [8], as células do câncer cervical não podem escapar de uma resposta imune através da perda de antígenos. Sem E6 e E7 funcionais, essas células deixariam de ser tumorigênicas. Portanto, as proteínas E6 e E7 representam alvos ideais para o desenvolvimento de imunoterapias específicas para antígenos ou vacinas para o câncer cervical.

Várias formas de vacinas, como vacinas baseadas em vetores, vacinas baseadas em tumores, vacinas baseadas em DNA e vacinas baseadas em proteínas/peptídeos, foram descritas em sistemas experimentais direcionados às proteínas E6 e/ou E7 do HPV-16 [9, 10]. Por exemplo, Meneguzzi et al. relataram que a inoculação de ratos com recombinantes de vaccinia que expressam HPV-16 E6 ou E7 retardou ou impediu o desenvolvimento de tumores em 25-47% dos ratos desafiados com uma linha celular tumorigênica de rato co-transfectada com HPV-16 e ras ativado [9]. Além disso, Chen et al. demonstraram que a imunização de camundongos com células não tumorigênicas singênicas transfectadas com o gene HPV-16 E7 confere proteção contra células tumorais singênicas positivas para HPV-16 E7 transplantadas [11]. Feltkamp et ai. identificou um epítopo CTL no HPV-16 E7 usando estudos de ligação de peptídeos H-2Kb e H-2Db MHC classe I. A imunização com este peptídeo tornou os camundongos resistentes a um desafio com células tumorais transformadas por HPV-16 [12]. Além disso, as partículas quiméricas semelhantes ao papilomavírus (CVLPs) consistem em proteínas quiméricas HPV-16 L1-E7 (Nieland et al., comunicação pessoal) ou HPV-16 L1/L2-E7 (Greenstone et al., comunicação pessoal). como vacinas terapêuticas contra tumores expressando HPV-16 E7 em modelos murinos. Mais recentemente, um ensaio clínico de fase I/II foi realizado em oito pacientes com câncer cervical em estágio avançado usando um vírus vaccinia recombinante vivo expressando as proteínas E6 e E7 dos HPV 16 e 18 (TA-HPV) [13]. Nesse estudo, não foram observados efeitos colaterais clínicos significativos ou contaminação ambiental por TA-HPV vivo [13].

Importância das respostas imunes mediadas por células no controle de infecções por HPV e neoplasias associadas ao HPV Várias linhas de evidência sugerem que as respostas imunes mediadas por células são importantes no controle de infecções por HPV e neoplasias associadas ao HPV (para revisão, consulte [14]). Primeiro, a prevalência de doenças relacionadas ao HPV (infecções e neoplasias) é aumentada em receptores de transplante [15] e pacientes infectados pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV) [16], ambos os quais são conhecidos por terem imunidade mediada por células prejudicada. Em segundo lugar, estudos em animais demonstraram que os animais imunizados são protegidos da infecção pelo papilomavírus e do desenvolvimento de neoplasias. A imunização também facilita a regressão das lesões existentes [17-19]. Em terceiro lugar, foram observadas células T infiltrantes CD4+ (células T auxiliares) e CD8+ (células T citotóxicas/supressoras) em verrugas com regressão espontânea [20] e quarto, verrugas em pacientes que estão em terapia imunossupressora geralmente desaparecem quando esse tratamento é descontinuado (por revisão, ver [21].

Respostas imunes celulares ao HPV A compreensão da imunidade mediada por células T às infecções por HPV foi facilitada pela identificação dos epítopos MHC classe I e classe II das proteínas do HPV. Vários grupos tentaram mapear epítopos de células T helper (Th) murinas [22-24] e humanas [25, 26] em proteínas de HPV. Vários grupos também tentaram mapear epítopos de linfócitos T citotóxicos (CTL) murinos [12, 27-30] e humanos [31-34] em proteínas de HPV. Kast et ai. identificaram vários peptídeos de ligação de alta afinidade das proteínas E6 e E7 do HPV-16 para alelos HLA-A humanos [32]. Além disso, CTLs específicos do HPV que reconhecem as proteínas E6 e E7 do HPV foram demonstrados no sangue periférico de pacientes com câncer cervical [13, 35], em doadores saudáveis ​​[33, 36] e em pacientes com lesões de NIC [34, 37, 38]. Além disso, a infiltração de tecido de câncer cervical com CTLs específicos de HPV foi recentemente descrita [39].

Respostas imunes mediadas por células em lesões infectadas por HPV podem ser demonstradas por testes cutâneos in vivo [40, 41], ensaios CTL in vitro [35, 37, 39] e resposta linfoproliferativa in vitro [25, 26, 42-48]. Por exemplo, Hopfl et al. usaram proteínas de HPV-16 expressas em bactérias para testes cutâneos em pacientes com lesões de NIC e encontraram respostas cutâneas específicas à proteína virion L1 e não à proteína E4 [40]. Em pacientes com lesões de NIC, CTLs específicos de HPV foram identificados em PBMC [35, 37] e em tecidos cervicais [39]. As respostas linfoproliferativas in vitro em pacientes com lesões de NIC têm sido ativamente investigadas. Por exemplo, de Gruijl et al. relataram que as respostas proliferativas de células T contra a proteína oncogênica E7 do HPV-16 foram mais proeminentes em pacientes com NIC com infecção persistente por HPV [45]. No entanto, Kadish et al. relataram que as respostas linfoproliferativas aos peptídeos E6 e E7 específicos do HPV-16 pareciam estar associadas à eliminação da infecção pelo HPV e à regressão das lesões de NIC [46].

Importância das funções das células T auxiliares na geração de respostas antitumorais eficazes Evidências crescentes sugerem que respostas antitumorais inadequadas podem resultar de uma falha do braço auxiliar da resposta imune. Os eventos que levam à ativação de CTL são estritamente regulados para proteger contra o desenvolvimento de respostas imunes inadequadas a antígenos próprios ou respostas exageradas a antígenos estranhos. Essa regulação é mediada por linfocinas produzidas pelas células auxiliares T CD4+. As células auxiliares T CD4+ são críticas para a geração de potentes respostas imunes antitumorais. Células T CD4+ demonstraram ser instrumentais na geração de respostas imunes contra várias malignidades sólidas em murinos [49, 50] e em humanos [51, 52]. Vários tumores de camundongos que são transfectados com genes MHC de classe II singênicos tornam-se vacinas muito eficazes contra o desafio subsequente com tumores negativos de classe II do tipo selvagem [53, 54]. Além disso, como células de memória cruciais no braço de células T do sistema imunológico, as células CD4+ podem fornecer imunidade de longo prazo contra antígenos específicos [55, 56].

Papel das citocinas na imunidade mediada por células A imunidade mediada por células é regulada por citocinas que são secretadas por células T helper. Em geral, as células T auxiliares podem ser classificadas como células Th1 e/ou Th2 com base nos diferentes tipos de citocinas que secretam. As células Th1 secretam interleucina (IL) 2 e interferon gama (IFN-). As células Th2 produzem IL-4, IL-5, IL-10 e IL-13. Os linfócitos Th1 são as células efetoras mais importantes em reações inflamatórias associadas com hipersensibilidade vigorosa do tipo retardada, mas baixa produção de anticorpos, como ocorre na dermatite de contato e em infecções bacterianas virais ou intracelulares (para revisão, ver [57, 58]). O fenótipo funcional da maioria das células Th2 pode explicar tanto a produção persistente de certos isotipos de anticorpos, particularmente IgG1 e IgE, quanto a eosinofilia observada em infecções helmínticas humanas e distúrbios alérgicos. Acredita-se que a proteção mediada por linfócitos contra infecções virais, bem como o controle de tumores, sejam mediados por respostas de citocinas Th1 e prejudicadas por respostas de citocinas Th2. É provável que a resposta Th1 produtora de IL-2 e IFN- seja o principal componente que contribui para o desenvolvimento da imunidade mediada por células contra infecções por HPV e neoplasias associadas ao HPV.

Vacinas quiméricas específicas para E7 podem controlar o modelo de tumor que expressa HPV16 E7 Com a cooperação do Prof. TC Wu no Johns Hopkins Medical Institutes, desenvolvemos com sucesso várias vacinas quiméricas de DNA, RNA e vetores de vírus para prevenir e tratar a expressão de HPV16 E7 tumor no modelo animal [59-61]. Descobrimos que essas vacinas de DNA quimérico E7 são capazes de prevenir e tratar o crescimento de tumores modelo murino que expressam E7. Esses resultados positivos dos modelos murinos pré-clínicos nos encorajaram a focar no desenvolvimento de vacinas contra o câncer e imunoterapia e aplicar essas vacinas em seres humanos.

No entanto, é muito importante estabelecer vários ensaios imunológicos específicos de E7 em seres humanos para avaliar o efeito da vacina contra o câncer ou imunoterapia em futuros ensaios clínicos. Assim, gostaríamos de fornecer esta proposta para abordar o desenvolvimento de ensaios imunológicos específicos para HPV 16 E7 em humanos. Existem vários objetivos neste projeto: 1) desenvolver e utilizar ensaios para medir CTLs para proteínas HPV 16 E7, 2) desenvolver e utilizar ensaios para medir respostas T helper (Th) a antígenos HPV 16 E7.