Lo sviluppo di test immunologici umani specifici per il papillomavirus di tipo 16 E7 nell'essere umano di tipo non HLA2

HPV e tumori cervicali I papillomavirus umani (HPV) sono piccoli virus a DNA privi di involucro che inducono tumori epiteliali della pelle o della mucosa. La maggior parte dei tumori è benigna, mostra una crescita limitata e di solito regredisce spontaneamente. Tuttavia, un certo numero di papillomavirus umani induce tumori che possono eventualmente progredire in carcinomi. I tipi di HPV genitale 16 e 18 e, meno frequentemente, i tipi 31, 33, 35, 45, 51 e 56, sono stati implicati nell'eziologia dei tumori cervicali e di altri tumori anogenitali. Circa 500.000 donne in tutto il mondo sviluppano ogni anno il cancro cervicale ed è la seconda causa di morte per cancro nelle donne [1]. Nei paesi sviluppati, il cancro della cervice si colloca dietro i tumori della mammella, del polmone, dell'utero e delle ovaie e rappresenta il 7% di tutti i tumori femminili. Negli Stati Uniti, ci sono circa 4.800 decessi all'anno per cancro cervicale [2]. Le prove che collegano gli HPV al cancro anogenitale provengono da studi epidemiologici e di laboratorio. Più del 90% dei tumori cervicali e dei loro precursori, la cosiddetta neoplasia intraepiteliale cervicale (CIN), contengono sequenze di DNA del papillomavirus umano (HPV) [3]. I tipi di HPV trovati nelle cellule tumorali hanno attività di trasformazione in studi in vitro [4] e le proteine ​​​​di trasformazione virale, E6 ed E7, sono costantemente espresse nelle linee cellulari di cancro cervicale [5] e nei tumori associati all'HPV dei pazienti [6]. Nella trasformazione maligna associata all'HPV, il DNA virale può essere integrato nel DNA cellulare e l'integrazione spesso porta alla delezione di ampi settori del genoma virale. I geni tardivi (L1 e L2) e alcuni geni precoci (E1 ed E2) vengono solitamente persi, lasciando E6 ed E7 come le uniche strutture di lettura aperte frequentemente riscontrate nei carcinomi. È probabile che l'espressione di E6 ed E7 superi la regolazione della proliferazione cellulare normalmente mediata da proteine ​​come p53 e Rb, consentendo una crescita incontrollata e fornendo il potenziale per la trasformazione maligna [7].

Le proteine ​​oncogeniche dell'HPV, E6 ed E7, come bersagli ideali per lo sviluppo di immunoterapie o vaccini specifici per l'antigene per i tumori maligni cervicali associati all'HPV E6 ed E7 rappresentano i bersagli ideali per lo sviluppo di immunoterapie o vaccini specifici per l'antigene per i tumori maligni associati all'HPV. Innanzitutto, oltre il 90% dei tumori cervicali è stato associato agli HPV, in particolare il tipo 16, e E6 ed E7 sono espressi in modo coerente nella maggior parte dei tumori cervicali. In secondo luogo, mentre la maggior parte degli antigeni tumore-specifici derivano da proteine ​​normali o da proteine ​​mutate, E6 ed E7 sono proteine ​​virali completamente estranee e potenzialmente possono ospitare più peptidi/epitopi antigenici rispetto a una proteina mutante (ad es. p53) o una proteina embrionale riattivata (es. MAGO-1). In terzo luogo, poiché E6 ed E7 sono necessari per l'induzione e il mantenimento del fenotipo maligno delle cellule tumorali [8], le cellule del cancro cervicale non possono eludere una risposta immunitaria attraverso la perdita dell'antigene. Senza E6 ed E7 funzionali, queste cellule cesserebbero di essere tumorigeniche. Pertanto, le proteine ​​E6 ed E7 rappresentano bersagli ideali per lo sviluppo di immunoterapie antigene-specifiche o vaccini per il cancro cervicale.

Varie forme di vaccini, come vaccini basati su vettori, vaccini basati su tumori, vaccini basati su DNA e vaccini basati su proteine/peptidi sono stati descritti in sistemi sperimentali mirati alle proteine ​​E6 e/o E7 dell'HPV-16 [9, 10]. Ad esempio, Meneguzzi et al. ha riportato che l'inoculazione di ratti con vaccinia ricombinanti che esprimono HPV-16 E6 o E7 ha ritardato o prevenuto lo sviluppo del tumore nel 25-47% dei ratti sfidati con una linea cellulare di ratto tumorigenica co-trasfettata con HPV-16 e ras attivato [9]. Inoltre, Chen et al. hanno dimostrato che l'immunizzazione di topi con cellule singeniche non tumorigeniche trasfettate con il gene E7 dell'HPV-16 conferisce protezione contro le cellule tumorali singeniche positive all'HPV-16 E7 trapiantate [11]. Feltcamp et al. ha identificato un epitopo CTL in HPV-16 E7 utilizzando studi di legame del peptide di classe I H-2Kb e H-2Db MHC. L'immunizzazione con questo peptide ha reso i topi resistenti a una sfida con cellule tumorali trasformate da HPV-16 [12]. Inoltre, sono state utilizzate particelle chimeriche simili al papillomavirus (CVLP) costituite da proteine ​​chimeriche HPV-16 L1-E7 (Nieland et al., comunicazione personale) o HPV-16 L1/L2-E7 (Greenstone et al., comunicazione personale) come vaccini terapeutici contro tumori che esprimono HPV-16 E7 in modelli murini. Più recentemente, uno studio clinico di fase I/II è stato condotto su otto pazienti con carcinoma cervicale in stadio avanzato utilizzando un virus vaccinico ricombinante vivo che esprime le proteine ​​E6 ed E7 dell'HPV 16 e 18 (TA-HPV) [13]. In quello studio non sono stati osservati effetti collaterali clinici significativi o contaminazione ambientale da TA-HPV vivo [13].

Importanza delle risposte immunitarie cellulo-mediate nel controllo sia delle infezioni da HPV che delle neoplasie associate all'HPV Diverse linee di evidenza suggeriscono che le risposte immunitarie cellulo-mediate sono importanti nel controllo sia delle infezioni da HPV che delle neoplasie associate all'HPV (per la revisione, vedere [14]). In primo luogo, la prevalenza delle malattie correlate all'HPV (infezioni e neoplasie) è aumentata nei pazienti trapiantati [15] e nei pazienti con infezione da virus dell'immunodeficienza umana (HIV) [16], entrambi noti per avere un'immunità cellulo-mediata compromessa. In secondo luogo, gli studi sugli animali hanno dimostrato che gli animali immunizzati sono protetti dall'infezione da papillomavirus e dallo sviluppo di neoplasie. L'immunizzazione facilita anche la regressione delle lesioni esistenti [17-19]. In terzo luogo, sono state osservate cellule T infiltranti CD4+ (cellule T helper) e CD8+ (cellule T citotossiche/soppressori) nelle verruche che regrediscono spontaneamente [20] e quarto, le verruche nei pazienti che sono in terapia immunosoppressiva spesso scompaiono quando questo trattamento viene interrotto (per revisione, vedi [21].

Risposte immunitarie cellulari all'HPV La comprensione dell'immunità mediata dalle cellule T alle infezioni da HPV è stata facilitata dall'identificazione degli epitopi MHC di classe I e di classe II delle proteine ​​dell'HPV. Diversi gruppi hanno tentato di mappare epitopi di cellule T helper (Th) murine [22-24] e umane [25, 26] sulle proteine ​​dell'HPV. Diversi gruppi hanno anche tentato di mappare epitopi murini [12, 27-30] e umani [31-34] di linfociti T citotossici (CTL) sulle proteine ​​dell'HPV. Cast et al. hanno identificato diversi peptidi leganti ad alta affinità delle proteine ​​E6 ed E7 dell'HPV-16 per gli alleli HLA-A umani [32]. Inoltre, CTL specifici per l'HPV che riconoscono le proteine ​​E6 ed E7 dell'HPV sono stati dimostrati nel sangue periferico di pazienti con cancro cervicale [13, 35], in donatori sani [33, 36] e in pazienti con lesioni CIN [34, 37, 38]. Inoltre, recentemente è stata descritta l'infiltrazione del tessuto tumorale cervicale con CTL specifici per l'HPV[39].

Le risposte immunitarie cellulo-mediate nelle lesioni infette da HPV possono essere dimostrate mediante test cutanei in vivo [40, 41], test CTL in vitro [35, 37, 39] e risposta linfoproliferativa in vitro [25, 26, 42-48]. Ad esempio, Hopfle et al. hanno utilizzato proteine ​​HPV-16 espresse battericamente per test cutanei in pazienti con lesioni CIN e hanno trovato risposte cutanee specifiche alla proteina virionica L1 e non alla proteina E4 [40]. Nei pazienti con lesioni CIN, CTL specifici per HPV sono stati identificati nelle PBMC [35, 37] e nei tessuti cervicali [39]. Le risposte linfoproliferative in vitro nei pazienti con lesioni CIN sono state attivamente studiate. Ad esempio, de Gruijl et al. hanno riferito che le risposte proliferative delle cellule T contro la proteina oncogenica HPV-16 E7 erano più importanti nei pazienti CIN con un'infezione persistente da HPV [45]. Tuttavia, Kadish et al. hanno riferito che le risposte linfoproliferative a specifici peptidi HPV-16 E6 ed E7 sembravano essere associate alla clearance dell'infezione da HPV e alla regressione delle lesioni CIN [46].

Importanza delle funzioni delle cellule T helper nella generazione di risposte antitumorali efficaci Prove crescenti hanno suggerito che risposte antitumorali inadeguate possono derivare da un fallimento del braccio helper della risposta immunitaria. Gli eventi che portano all'attivazione di CTL sono strettamente regolati al fine di proteggere dallo sviluppo di risposte immunitarie inappropriate agli antigeni self o risposte esagerate agli antigeni estranei. Questa regolazione è mediata dalle linfochine prodotte dalle cellule T helper CD4+. Le cellule T helper CD4+ sono fondamentali per la generazione di potenti risposte immunitarie antitumorali. Le cellule T CD4+ hanno dimostrato di essere strumentali nel generare risposte immunitarie contro diverse neoplasie solide nel murino [49, 50] e nell'uomo [51, 52]. Diversi tumori di topo che vengono trasfettati con geni singenici MHC di classe II diventano vaccini molto efficaci contro la successiva sfida con tumori wild type di classe II negativi [53, 54]. Inoltre, in quanto cellule di memoria cruciali nel braccio delle cellule T del sistema immunitario, le cellule CD4+ possono essere in grado di fornire immunità a lungo termine contro specifici antigeni [55, 56].

Ruolo delle citochine nell'immunità cellulo-mediata L'immunità cellulo-mediata è regolata dalle citochine secrete dalle cellule T helper. In generale, le cellule T helper possono essere classificate come cellule Th1 e/o Th2 in base ai diversi tipi di citochine che secernono. Le cellule Th1 secernono interleuchina (IL) 2 e interferone gamma (IFN-). Le cellule Th2 producono IL-4, IL-5, IL-10 e IL-13. I linfociti Th1 sono le cellule effettrici più importanti nelle reazioni infiammatorie associate a vigorosa ipersensibilità di tipo ritardato ma bassa produzione di anticorpi, come accade nella dermatite da contatto e nelle infezioni batteriche virali o intracellulari (per la revisione, vedere [57, 58]). Il fenotipo funzionale della maggior parte delle cellule Th2 può spiegare sia la produzione persistente di alcuni isotipi anticorpali, in particolare IgG1 e IgE, sia l'eosinofilia osservata nelle infezioni da elminti umani e nei disturbi allergici. Si ritiene che la protezione mediata dai linfociti dalle infezioni virali e il controllo dei tumori siano mediati dalle risposte delle citochine Th1 e compromessi dalle risposte delle citochine Th2. È probabile che la risposta Th1 che produce IL-2 e IFN- sia la componente principale che contribuisce allo sviluppo dell'immunità cellulo-mediata contro le infezioni da HPV e le neoplasie associate all'HPV.

I vaccini chimerici specifici per E7 possono controllare il modello tumorale che esprime l'HPV16 E7 Collaborando con il Prof. TC Wu presso il Johns Hopkins Medical Institutes, abbiamo sviluppato con successo diversi vaccini chimerici a DNA, RNA e vettore di virus per prevenire e curare l'espressione dell'HPV16 E7 tumore nel modello animale [59-61]. Abbiamo scoperto che questi vaccini a DNA E7-chimerico sono in grado di prevenire e trattare la crescita di tumori modello murino che esprimono E7. Questi risultati positivi dei modelli murini preclinici ci hanno incoraggiato a concentrarci sullo sviluppo del vaccino contro il cancro e dell'immunoterapia e ad applicare questi vaccini a soggetti umani.

Tuttavia, è molto importante impostare vari test immunologici specifici per E7 sull'essere umano per valutare l'effetto del vaccino contro il cancro o dell'immunoterapia nei futuri studi clinici. Quindi vorremmo fornire questa proposta per affrontare lo sviluppo di test immunologici specifici per HPV 16 E7 nell'essere umano. Ci sono diversi obiettivi in ​​questo progetto: 1) sviluppare e utilizzare saggi per misurare i CTL alle proteine ​​E7 dell'HPV 16, 2) sviluppare e utilizzare saggi per misurare le risposte T helper (Th) agli antigeni E7 dell'HPV 16.