비 HLA2형 인간에서 인간 유두종 바이러스 16형 E7 특이적 인간 면역학적 분석의 개발

HPV 및 자궁경부암 인간 유두종 바이러스(HPV)는 피부 또는 점막의 상피 종양을 유발하는 작고 비외피형 DNA 바이러스입니다. 대부분의 종양은 양성이며 제한된 성장을 보이며 일반적으로 자발적으로 퇴행합니다. 그러나 다수의 인간 유두종 바이러스는 결국 암종으로 진행될 수 있는 종양을 유발합니다. 생식기 HPV ​​유형 16 및 18, 덜 빈번한 유형 31, 33, 35, 45, 51 및 56은 자궁경부암 및 기타 항문생식기암의 원인과 관련이 있습니다. 매년 전 세계적으로 약 500,000명의 여성이 자궁경부암에 걸리며 이는 여성 암으로 인한 사망의 두 번째 주요 원인입니다[1]. 선진국에서 자궁경부암은 유방암, 폐암, 자궁암, 난소암 다음 순위이며 전체 여성 암의 7%를 차지합니다. 미국에서는 자궁경부암으로 매년 약 4,800명이 사망합니다[2]. HPV와 항문생식기암을 연결하는 증거는 역학 및 실험실 연구에서 나옵니다. 자궁경부암과 그 전구체, 소위 자궁경부 상피내종양(CIN)의 90% 이상이 인유두종바이러스(HPV) DNA 염기서열을 포함합니다[3]. 암세포에서 발견되는 HPV 유형은 시험관 연구[4]에서 변형 활성을 가지며 바이러스 변형 단백질인 E6 및 E7은 자궁경부암 세포주[5]와 환자의 HPV 관련 암[6]에서 일관되게 발현됩니다. HPV 관련 악성 형질전환에서 바이러스 DNA는 세포 DNA에 통합될 수 있으며 통합은 종종 바이러스 게놈의 큰 부분을 삭제합니다. 후기 유전자(L1 및 L2)와 일부 초기 유전자(E1 및 E2)는 일반적으로 소실되어 E6 및 E7이 암종에서 자주 발견되는 유일한 열린 판독 프레임으로 남습니다. E6 및 E7의 발현은 p53 및 Rb와 같은 단백질에 의해 일반적으로 매개되는 세포 증식의 조절을 극복할 가능성이 있어 제어되지 않는 성장을 허용하고 악성 형질전환의 가능성을 제공합니다[7].

HPV 관련 자궁경부 악성종양에 대한 항원 특이적 면역요법 또는 백신 개발을 위한 이상적인 표적으로서의 HPV 발암성 단백질 E6 및 E7 E6 및 E7은 HPV 관련 악성종양에 대한 항원 특이적 면역요법 또는 백신 개발을 위한 이상적인 표적을 나타냅니다. 첫째, 자궁경부암의 90% 이상이 HPV, 특히 유형 16과 관련이 있으며 E6 및 E7은 대부분의 자궁경부암에서 일관되게 발현됩니다. 둘째, 대부분의 종양 특이적 항원은 정상 단백질 또는 돌연변이 단백질에서 유래하지만 E6 및 E7은 완전히 외부 바이러스 단백질이며 잠재적으로 돌연변이 단백질(즉, p53) 또는 재활성화된 배아 단백질(즉, 마법사-1). 셋째, E6과 E7은 암세포의 악성 표현형 유도 및 유지에 필요하기 때문에[8], 자궁경부암 세포는 항원 소실을 통한 면역반응을 회피할 수 없다. 기능적 E6 및 E7이 없으면 이러한 세포는 종양 형성을 중단합니다. 따라서 E6 및 E7 단백질은 자궁경부암에 대한 항원 특이적 면역 요법 또는 백신 개발을 위한 이상적인 표적입니다.

벡터 기반 백신, 종양 기반 백신, DNA 기반 백신 및 단백질/펩티드 기반 백신과 같은 다양한 형태의 백신이 HPV-16 E6 및/또는 E7 단백질을 대상으로 하는 실험 시스템에서 설명되었습니다[9, 10]. 예를 들어, Meneguzzi 외. HPV-16 E6 또는 E7을 발현하는 백시니아 재조합체를 랫트에 접종하면 HPV-16 및 활성화된 ras로 공동 형질감염된 종양형성 랫트 세포주로 챌린지된 랫트의 25-47%에서 종양 발달이 지연되거나 예방되었다고 보고되었습니다[9]. 또한, Chen et al. HPV-16 E7 유전자로 형질감염된 동계 비종양형성 세포로 마우스를 면역화하면 이식된 HPV-16 E7 양성 동계 종양 세포에 대한 보호를 부여한다는 것이 입증되었습니다[11]. Feltkampet al. H-2Kb 및 H-2Db MHC 클래스 I-펩티드 결합 연구를 사용하여 HPV-16 E7에서 CTL 에피토프를 확인했습니다. 이 펩타이드로 면역화하면 마우스가 HPV-16 형질전환 종양 세포에 저항성을 갖게 됩니다[12]. 또한 HPV-16 L1-E7(Nieland et al., 개인 통신) 또는 HPV-16 L1/L2-E7(Greenstone et al., 개인 통신) 키메라 단백질로 구성된 키메라 유두종 바이러스 유사 입자(CVLP)가 사용되었습니다. 뮤린 모델에서 종양을 발현하는 HPV-16 E7에 대한 치료용 백신으로서. 보다 최근에는 HPV 16 및 18(TA-HPV)의 E6 및 E7 단백질을 발현하는 생 재조합 백시니아 바이러스를 사용하여 말기 자궁경부암 환자 8명을 대상으로 1상/2상 임상 시험이 수행되었습니다[13]. 그 연구에서 살아있는 TA-HPV에 의한 심각한 임상적 부작용이나 환경 오염은 관찰되지 않았습니다[13].

HPV 감염 및 HPV 관련 신생물 모두를 통제하는 데 있어 세포 매개 면역 반응의 중요성 몇 가지 증거는 세포 매개 면역 반응이 HPV 감염 및 HPV 관련 신생물 모두를 통제하는 데 중요하다는 것을 시사합니다(검토를 위해 [14] 참조). 첫째, HPV 관련 질병(감염 및 신생물)의 유병률은 이식 수혜자[15]와 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 감염 환자[16]에서 증가하며, 이들 모두 세포 매개 면역이 손상된 것으로 알려져 있습니다. 둘째, 동물 연구를 통해 면역화된 동물이 유두종바이러스 감염과 종양 발생으로부터 보호된다는 사실이 입증되었습니다. 예방접종은 또한 기존 병변의 퇴행을 촉진합니다[17-19]. 셋째, 침윤성 CD4+(T helper 세포) 및 CD8+(세포독성/억제 T 세포) T 세포가 자발적으로 퇴행하는 사마귀에서 관찰되었습니다[20]. 검토, [21] 참조.

HPV에 대한 세포 면역 반응 HPV 감염에 대한 T 세포 매개 면역에 대한 이해는 HPV 단백질의 MHC 클래스 I 및 클래스 II 에피토프를 식별함으로써 촉진되었습니다. 여러 그룹에서 쥐[22-24] 및 인간[25, 26] T 도우미(Th) 세포 에피토프를 HPV 단백질에 매핑하려고 시도했습니다. 몇몇 그룹은 또한 쥐[12, 27-30]뿐만 아니라 인간[31-34] 세포독성 T-림프구(CTL) 에피토프를 HPV 단백질에 매핑하려고 시도했습니다. Kastet al. 인간 HLA-A 대립유전자에 대한 HPV-16 E6 및 E7 단백질의 여러 고친화성 결합 펩티드를 확인했습니다[32]. 또한 HPV E6 및 E7 단백질을 인식하는 HPV 특이 CTL은 자궁경부암 환자의 말초 혈액[13, 35], 건강한 기증자[33, 36] 및 CIN 병변 환자[34, 37, 38]에서 입증되었습니다. 또한, HPV 특이 CTL로 자궁경부암 조직에 침윤하는 것이 최근에 기술되었습니다[39].

HPV 감염 병변의 세포 매개 면역 반응은 생체 내 피부 검사[40, 41], 시험관 내 CTL 분석[35, 37, 39] 및 시험관 내 림프증식 반응[25, 26, 42-48]에 의해 입증될 수 있습니다. 예를 들어, Hopfl 외. CIN 병변 환자의 피부 검사를 위해 박테리아로 발현된 HPV-16 단백질을 사용했으며 E4 단백질이 아닌 비리온 단백질 L1에 대한 특정 피부 반응을 발견했습니다[40]. CIN 병변이 있는 환자의 경우 PBMC[35, 37]와 자궁경부 조직[39]에서 HPV 특이 CTL이 확인되었습니다. CIN 병변이 있는 환자의 시험관 내 림프증식 반응이 활발히 조사되었습니다. 예를 들어 de Gruijl 외. HPV-16 E7 발암 단백질에 대한 T 세포 증식 반응은 HPV 감염이 지속된 CIN 환자에서 가장 두드러졌다고 보고했습니다[45]. 그러나 Kadish et al. 특정 HPV-16 E6 및 E7 펩타이드에 대한 림프증식 반응이 HPV 감염 제거 및 CIN 병변의 퇴행과 관련이 있는 것으로 나타났다[46].

효과적인 항종양 반응 생성에 있어서 헬퍼 T 세포 기능의 중요성 증가하는 증거에 따르면 부적절한 항종양 반응은 면역 반응의 헬퍼 암의 실패로 인해 발생할 수 있습니다. CTL의 활성화로 이어지는 사건은 자기 항원에 대한 부적절한 면역 반응의 발달 또는 외부 항원에 대한 과장된 반응으로부터 보호하기 위해 엄격하게 규제됩니다. 이 조절은 CD4+ T 헬퍼 세포에 의해 생성된 림포카인에 의해 매개됩니다. CD4+ T 헬퍼 세포는 강력한 항종양 면역 반응 생성에 중요합니다. CD4+ T 세포는 쥐[49, 50]와 인간[51, 52]에서 여러 고형 악성 종양에 대한 면역 반응을 생성하는 데 중요한 역할을 하는 것으로 나타났습니다. 동계 MHC 클래스 II 유전자로 형질감염된 여러 마우스 종양은 야생형 클래스 II 음성 종양으로의 후속 공격에 대해 매우 효과적인 백신이 됩니다[53, 54]. 또한, 면역 체계의 T 세포 팔에 있는 중요한 기억 세포로서 CD4+ 세포는 특정 항원에 대한 장기 면역을 제공할 수 있습니다[55, 56].

세포 매개 면역에서 사이토카인의 역할 세포 매개 면역은 T 헬퍼 세포에서 분비되는 사이토카인에 의해 조절됩니다. 일반적으로 T 헬퍼 세포는 분비하는 사이토카인의 종류에 따라 Th1 및/또는 Th2 세포로 분류할 수 있습니다. Th1 세포는 인터루킨(IL) 2와 인터페론 감마(IFN-)를 분비합니다. Th2 세포는 IL-4, IL-5, IL-10 및 IL-13을 생성합니다. Th1 림프구는 접촉성 피부염 및 바이러스 또는 세포내 박테리아 감염에서 발생하는 것과 같이 격렬한 지연형 과민성과 관련된 염증 반응에서 가장 중요한 효과기 세포이지만 항체 생성은 낮습니다(검토를 위해 [57, 58] 참조). 대부분의 Th2 세포의 기능적 표현형은 특정 항체 이소형, 특히 IgG1 및 IgE의 지속적인 생산과 인간 기생충 감염 및 알레르기 질환에서 관찰되는 호산구 증가증을 설명할 수 있습니다. 바이러스 감염으로부터의 림프구 매개 보호 및 종양 제어는 Th1 사이토카인 반응에 의해 매개되고 Th2 사이토카인 반응에 의해 손상되는 것으로 생각됩니다. Th1 반응을 생성하는 IL-2 및 IFN-은 HPV 감염 및 HPV 관련 신생물에 대한 세포 매개 면역 발달에 기여하는 주요 구성 요소일 가능성이 높습니다.

키메라 E7 특이적 백신은 HPV16 E7 발현 종양 모델을 제어할 수 있습니다 존스 홉킨스 의학 연구소의 TC Wu 교수와 협력하여 HPV16 E7 발현 종양 모델을 예방하고 치료하기 위한 몇 가지 키메라 DNA, RNA 및 바이러스 벡터 백신을 성공적으로 개발했습니다 동물 모델의 종양[59-61]. 우리는 이러한 E7-키메라 DNA 백신이 E7을 발현하는 쥐 모델 종양의 성장을 예방하고 치료할 수 있음을 발견했습니다. 전임상 쥐 모델의 이러한 긍정적인 결과는 우리가 암 백신 및 면역 요법의 개발에 집중하고 이러한 백신을 인간 피험자에게 적용하도록 격려했습니다.

그러나 향후 임상시험에서 암백신이나 면역치료의 효과를 평가하기 위해서는 인간에 대한 다양한 E7 특이적 면역학적 분석법을 설정하는 것이 매우 중요하다. 그래서 우리는 인간에 대한 HPV 16 E7 특이적 면역 분석의 개발을 다루기 위해 이 제안을 제공하고자 합니다. 이 프로젝트에는 몇 가지 목표가 있습니다. 1) HPV 16 E7 단백질에 대한 CTL을 측정하기 위한 분석법을 개발하고 활용하는 것, 2) HPV 16 E7 항원에 대한 T 헬퍼(Th) 반응을 측정하기 위한 분석법을 개발하고 활용하는 것입니다.