Utvecklingen av humant papillomvirus typ 16 E7-specifika humana immunologiska analyser i icke-HLA2-typ människa

HPV och livmoderhalscancer Humant papillomvirus (HPV) är små DNA-virus utan hölje som inducerar epiteltumörer i hud eller slemhinnor. Majoriteten av tumörerna är godartade, visar begränsad tillväxt och går vanligtvis tillbaka spontant. Ett antal humana papillomvirus inducerar emellertid tumörer som så småningom kan utvecklas till karcinom. De genitala HPV-typerna 16 och 18, och mer sällan, typerna 31, 33, 35, 45, 51 och 56, har varit inblandade i etiologin av livmoderhalscancer och andra anogenitala cancerformer. Cirka 500 000 kvinnor världen över utvecklar livmoderhalscancer årligen och det är den näst vanligaste dödsorsaken till cancer hos kvinnor [1]. I utvecklade länder ligger cancer i livmoderhalsen bakom cancer i bröst, lungor, livmoder och äggstockar och står för 7 % av all cancer hos kvinnor. I USA är det cirka 4 800 dödsfall årligen i livmoderhalscancer [2]. Bevisen som kopplar HPV till anogenital cancer kommer från epidemiologiska studier och laboratoriestudier. Mer än 90 % av livmoderhalscancer och deras prekursorer, så kallad cervical intraepitelial neoplasia (CIN), innehåller humant papillomvirus (HPV) DNA-sekvenser [3]. De HPV-typer som finns i cancerceller har transformerande aktivitet i in vitro-studier [4] och de virala transformerande proteinerna, E6 och E7, uttrycks konsekvent i livmoderhalscancercellinjer [5] och i HPV-associerade cancerformer hos patienter [6]. I HPV-associerad malign transformation kan viralt DNA integreras i det cellulära DNA:t och integrering resulterar ofta i deletion av stora sektorer av det virala genomet. Sena gener (L1 och L2) och några tidiga gener (E1 och E2) går vanligtvis förlorade, vilket lämnar E6 och E7 som de enda öppna läsramarna som ofta finns i karcinom. Uttryck av E6 och E7 kommer sannolikt att övervinna regleringen av cellproliferation som normalt medieras av proteiner som p53 och Rb, vilket möjliggör okontrollerad tillväxt och ger potentialen för malign transformation [7].

HPV onkogena proteiner, E6 och E7, som idealiska mål för utvecklingen av antigenspecifika immunterapier eller vacciner för HPV-associerade cervikala maligniteter E6 och E7 representerar idealiska mål för utvecklingen av antigenspecifika immunterapier eller vacciner för HPV-associerade maligniteter. För det första har mer än 90% av livmoderhalscancer associerats med HPV, särskilt typ 16, och E6 och E7 uttrycks konsekvent i de flesta livmoderhalscancer. För det andra, medan de flesta tumörspecifika antigener härrör från normala proteiner eller muterat protein, är E6 och E7 fullständigt främmande virala proteiner och kan potentiellt hysa fler antigena peptider/epitoper än ett muterat protein (dvs. p53) eller ett reaktiverat embryonalt protein (dvs. MAGE-1). För det tredje, eftersom E6 och E7 krävs för induktion och underhåll av maligna fenotyper av cancerceller [8], kan celler av livmoderhalscancer inte undvika ett immunsvar genom antigenförlust. Utan funktionella E6 och E7 skulle dessa celler upphöra att vara tumörframkallande. Därför representerar E6- och E7-proteiner idealiska mål för att utveckla antigenspecifika immunterapier eller vacciner mot livmoderhalscancer.

Olika former av vacciner, såsom vektorbaserade vacciner, tumörbaserade vacciner, DNA-baserade vacciner och protein/peptidbaserade vacciner har beskrivits i experimentella system riktade mot HPV-16 E6- och/eller E7-proteiner [9, 10]. Till exempel, Meneguzzi et al. rapporterade att inokulering av råttor med vaccinia-rekombinanter som uttrycker HPV-16 E6 eller E7 fördröjde eller förhindrade tumörutveckling hos 25-47% av råttorna som utmanats med en tumörframkallande råttcellinje samtransfekterad med HPV-16 och aktiverat ras [9]. Dessutom har Chen et al. visade att immunisering av möss med syngena icke-tumorogena celler transfekterade med HPV-16 E7-genen ger skydd mot transplanterade HPV-16 E7-positiva syngena tumörceller [11]. Feltkamp et al. identifierade en CTL-epitop i HPV-16 E7 med användning av H-2Kb och H-2Db MHC klass I-peptidbindningsstudier. Immunisering med denna peptid gjorde möss resistenta mot en utmaning med HPV-16 transformerade tumörceller [12]. Dessutom har chimära papillomvirusliknande partiklar (CVLP) använts av HPV-16 L1-E7 (Nieland et al., personlig kommunikation) eller HPV-16 L1/L2-E7 (Greenstone et al., personlig kommunikation) chimära proteiner har använts som terapeutiska vacciner mot HPV-16 E7-uttryckande tumörer i murina modeller. På senare tid utfördes en klinisk fas I/II-prövning på åtta patienter med livmoderhalscancer i sent stadium med användning av ett levande rekombinant vacciniavirus som uttrycker E6- och E7-proteinerna från HPV 16 och 18 (TA-HPV) [13]. I den studien observerades inga signifikanta kliniska biverkningar eller miljöförorening av levande TA-HPV [13].

Betydelsen av cellmedierade immunsvar för att kontrollera både HPV-infektioner och HPV-associerade neoplasmer Flera bevis tyder på att cellmedierade immunsvar är viktiga för att kontrollera både HPV-infektioner och HPV-associerade neoplasmer (för granskning, se [14]). För det första är prevalensen av HPV-relaterade sjukdomar (infektioner och neoplasmer) ökad hos transplanterade [15] och humant immunbristvirus (HIV) infekterade patienter [16], som båda är kända för att ha nedsatt cellmedierad immunitet. För det andra har djurstudier visat att immuniserade djur är skyddade från papillomvirusinfektion och från utvecklingen av neoplasi. Immunisering underlättar också regression av befintliga lesioner [17-19]. För det tredje har infiltrerande CD4+ (T-hjälparceller) och CD8+ (cytotoxiska/suppressor T-celler) T-celler observerats i spontant regresserande vårtor [20] och för det fjärde försvinner vårtor hos patienter som är på immunsuppressiv terapi ofta när denna behandling avbryts (f. recension, se [21].

Cellulära immunsvar mot HPV Förståelsen av T-cellsmedierad immunitet mot HPV-infektioner underlättades genom identifiering av MHC klass I- och klass II-epitoper av HPV-proteiner. Flera grupper har försökt kartlägga murina [22-24] och humana [25, 26] T-hjälparcellepitoper (Th) på HPV-proteiner. Flera grupper har också försökt kartlägga murina [12, 27-30] såväl som humana [31-34] cytotoxiska T-lymfocytepitoper (CTL) på HPV-proteiner. Kast et al. har identifierat flera högaffinitetsbindande peptider av HPV-16 E6- och E7-proteiner för humana HLA-A-alleler [32]. Dessutom har HPV-specifika CTLs som känner igen HPV E6 och E7-proteiner visats i perifert blod hos patienter med livmoderhalscancer [13, 35], hos friska donatorer [33, 36] och hos patienter med CIN-lesioner [34, 37, 38]. Dessutom har infiltration av livmoderhalscancervävnad med HPV-specifika CTL nyligen beskrivits [39].

Cellmedierade immunsvar i HPV-infekterade lesioner kan påvisas genom in vivo hudtester [40, 41], in vitro CTL-analyser [35, 37, 39] och in vitro lymfoproliferativ respons [25, 26, 42-48]. Till exempel, Hopfl et al. har använt bakteriellt uttryckta HPV-16-proteiner för hudtester hos patienter med CIN-lesioner och har hittat specifika hudsvar på virionproteinet L1 och inte E4-proteinet [40]. Hos patienter med CIN-lesioner har HPV-specifika CTL identifierats i PBMC [35, 37] och i livmoderhalsvävnader [39]. De lymfoproliferativa responserna in vitro hos patienter med CIN-lesioner har aktivt undersökts. Till exempel har de Gruijl et al. rapporterade att T-cellsproliferativa svar mot HPV-16 E7 onkogent protein var mest framträdande hos CIN-patienter med en ihållande HPV-infektion [45]. Kadish et al. rapporterade att lymfoproliferativa svar på specifika HPV-16 E6- och E7-peptider verkade vara associerade med eliminering av HPV-infektion och regression av CIN-lesioner [46].

Betydelsen av hjälpar-T-cellsfunktioner för att generera effektiva antitumörsvar. Allt fler bevis har antytt att otillräckliga antitumörsvar kan bli resultatet av ett misslyckande i immunsvarets hjälparm. Händelserna som leder till aktiveringen av CTL är hårt reglerade för att skydda mot utvecklingen av olämpliga immunsvar mot självantigener eller överdrivna svar mot främmande antigener. Denna reglering förmedlas av lymfokiner som produceras av CD4+ T-hjälparceller. CD4+ T-hjälparceller är avgörande för genereringen av potenta antitumörimmunsvar. CD4+ T-celler har visat sig vara avgörande för att generera immunsvar mot flera fasta maligniteter hos murina [49, 50] och hos människor [51, 52]. Flera mustumörer som är transfekterade med syngena MHC klass II-gener blir mycket effektiva vacciner mot efterföljande utmaning med vildtypsklass II-negativa tumörer [53, 54]. Som viktiga minnesceller i immunsystemets T-cellsarm kan CD4+-celler dessutom kunna ge långsiktig immunitet mot specifika antigener [55, 56].

Cytokinernas roll i cellförmedlad immunitet Cellförmedlad immunitet regleras av cytokiner som utsöndras av T-hjälparceller. I allmänhet kan T-hjälparceller klassificeras som Th1- och/eller Th2-celler baserat på de olika typer av cytokiner de utsöndrar. Th1-celler utsöndrar interleukin (IL) 2 och interferon gamma (IFN-). Th2-celler producerar IL-4, IL-5, IL-10 och IL-13. Th1-lymfocyterna är de viktigaste effektorcellerna i inflammatoriska reaktioner förknippade med kraftig överkänslighet av fördröjningstyp men låg antikroppsproduktion, vilket sker vid kontaktdermatit och vid virala eller intracellulära bakteriella infektioner (för översikt, se [57, 58]). Den funktionella fenotypen hos de flesta Th2-celler kan stå för både den ihållande produktionen av vissa antikroppsisotyper, särskilt IgG1 och IgE, och eosinofili som observeras vid humana helmintiska infektioner och allergiska störningar. Lymfocytmedierat skydd mot virusinfektioner såväl som kontroll av tumörer tros förmedlas av Th1-cytokinsvar och försämras av Th2-cytokinsvar. Det IL-2- och IFN--producerande Th1-svaret är sannolikt den huvudsakliga komponenten som bidrar till utvecklingen av cellmedierad immunitet mot HPV-infektioner och HPV-associerade neoplasmer.

Chimära E7-specifika vacciner kan kontrollera den HPV16 E7-uttryckande tumörmodellen I samarbete med Prof. TC Wu vid Johns Hopkins Medical Institutes har vi framgångsrikt utvecklat flera chimära DNA-, RNA- och virusvektorvacciner för att förebygga och behandla HPV16 E7-uttryckande tumör i djurmodellen [59-61]. Vi fann att dessa E7-chimära DNA-vacciner är kapabla att förhindra och behandla tillväxten av murina modelltumörer som uttrycker E7. Dessa positiva resultat från de prekliniska murina modellerna har uppmuntrat oss att fokusera på utvecklingen av cancervaccin och immunterapi och tillämpa dessa vacciner på människor.

Det är dock mycket viktigt att sätta upp olika E7-specifika immunologiska analyser av människa för att utvärdera effekten av cancervaccin eller immunterapi i framtida kliniska prövningar. Så vi skulle vilja ge detta förslag för att ta itu med utvecklingen av HPV 16 E7-specifika immunologiska analyser hos människa. Det finns flera syften med detta projekt: 1) att utveckla och använda analyser för att mäta CTL till HPV 16 E7-proteiner, 2) att utveckla och använda analyser för att mäta T-hjälparsvar (Th) på HPV 16 E7-antigener.