Effektiviteten av malariabehandling i Mexiko (EMTM)

Malaria är i pre-elimineringsstatus i Mexiko (Rodriguez et al., 2011; WHO, 2012) den lokala överföringen av Plasmodium falciparum avbröts sedan 2000, och överföringen av P. vivax, det enda orsakande ämnet i landet, reduceras till mycket få hot spots (Hälsoministeriet - Mexiko, 1995-2005, Pan American Health Organization (PAHO), 2008, WHO, 2012).

Klorokin (CQ) och primakin (PQ) används sedan 1940 för att behandla P. vivax-blod- och leverinfektioner i de flesta drabbade områden över hela världen (Coatney, 1963). Men P. vivax resistent mot CQ har successivt rapporterats i olika geografiska regioner sedan slutet av 80-talet (Baird 1995). Klorokin, rekommenderas inte längre som monoterapi WHO, 2010, administrerat (25 mg/kg kroppsvikt) under tre på varandra följande dagar (10,10 och 5 mg/kg kroppsvikt) i kombination med PQ (0,25 - 0,75 mg/ Kg kroppsvikt) under 14 dagar, används fortfarande i regioner där parasiter är mottagliga (White, 1998; WHO, 2010). 14-dagarsregimen botar effektivt primära blodinfektioner och förhindrar återfall hos minst 90 % av patienterna (Galappaththy et al., 2007).

I Mexiko har CQ i kombination med PQ använts som standardbehandling för P. vivax malaria sedan 50-talet av det senaste århundradet. Men PQ-behandlingen slutförs ofta inte på grund av oönskade biverkningar som magbesvär. På platser där det är svårtillgängligt kan de förlängda intervallen mellan blodprovstagning, parasitologisk diagnos och behandling av patienter ta så lång tid som 3-4 veckor. För att minska risken för överföring togs därför blodprov från patienter med feber i avlägsna områden och behandlades omedelbart med en engångsdos på 10 mg CQ och 0,75 mg PQ/kg kroppsvikt, och, först efter mikroskopisk bekräftelse, en intermittent enkeldosregim ( ISD) administrerades (Mendez et al., 1994; Channon et al., 2003; NOM-032-SSA2-2002).

Den första enkla kombinerade CQ-PQ administreras fortfarande och den förväntas eliminera blodparasiter eftersom PQ kan förstöra parasiter som överlever från effekten av CQ [Murphy et al., 1991), och den upprepade administreringen av ISD var avsedd att undertrycka återfall av parasitemi (Mendez et al., 1994). Dess effektivitet har dock inte utvärderats.

Bedömning och övervakning av effektiviteten hos de implementerade behandlingsstrategierna är nödvändiga för att gå vidare mot malariaeliminering i regionen (malERA, 2011).

Metod Denna studie godkändes av den etiska granskningskommittén vid National Institute of Public Health (INSP), Mexiko. Informerat samtycke erhölls från alla patienter och vårdnadshavare för patienter under 18 år.

Studien följde Världshälsoorganisationen (WHO) in vivo testprotokoll för övervakning av antimalarialäkemedelsresistens. Eftersom tidiga skov kan inträffa efter 17 dagar efter primär blodinfektion, följdes patienterna upp under ≈dag 28 och från en månad och upp till 12 månader för att övervaka elimineringen av återfall. När det krävdes, implementerades ett flexibelt schema för att underlätta patienternas uppföljning och minimera förlorade patienter som andra föreslagit (Ruebush et al., 2003).

Studieplats. Studien genomfördes i Tapachula kommun och omgivande samhällen i södra Chiapas, Mexiko, som gränsar till Guatemala. Patientrekrytering genomfördes i diagnosanläggningen vid det regionala centret för folkhälsoforskning-INSP (CRISP) i Tapachula City, där febrila personer som söker malariadiagnos och behandling får gratis tjänster.

Provstorlek. En minsta urvalsstorlek av deltagare per grupp förväntades enligt Världshälsoorganisationen för kliniska studier i Amerika ((WHO, 2009; PAHO, 2010). Det totala antalet patienter som registrerades under studieperioden bestämdes dock av antalet fall som diagnostiserades med P. vivax som uppfyller inklusionskriterierna och accepterade att delta.

Patientregistrering. En symtomatisk patient definierades som en person som uppvisade feber eller två andra malariasymtom. Patienter rekryterades från februari 2008 till oktober 2009 enligt inklusions- och uteslutningskriterierna (se behörighetskriterierna). Inkluderade patienter randomiserades till att få antingen kombinerad CQ- och PQ-medicin i ISD- eller T14-scheman, men patienter som bodde i Tapachula City och närliggande föredrogs att få T14 för att underlätta daglig behandlingsövervakning. Samma dag för diagnos och föregående behandlingsadministrering (dag 0; datum annoterat) undersöktes patienterna för axiell temperatur i celsiusgrad (°C), kroppsvikt (i kg), mjältsvullnad och förekomst av kliniska symtom inom de tidigare 48 h som feber, huvudvärk, myalgi och artralgi. Tecken på erytem och gulsot fastställdes på dagen för inskrivningen. För parasitologisk och molekylär analys uppsamlades kapillärblod genom fingerstickning för att framställa tunna respektive tjocka utstryk och för att impregnera filterpapper (Whatman #2). Andra demografiska data samlades in med hjälp av ett frågeformulär t.ex. ålder, kön, tidigare klorokin- och primakinintag och malariainfektioner m.m.

Patientbehandling och uppföljning. Den rekommenderade dosen för en engångsdos bestod av 10 mg/kg CQ-fosfat och 0,75 mg/kg primakin. Patienter under ISD var schemalagda att ta en engångsdos dag 0, 30, 60, 180, 210 och 240. Å andra sidan inkluderade den optimala dosen av T14 25 mg/kg CQ administrerat under en 3-dagarsperiod (10 mg/kg dag 0 och 1 och 5 mg/kg dag 2) och PQ vid 0,25 mg/kg /dag under 14 dagar (WHO, 2010). Båda behandlingsregimerna justerades dock till patienternas ålder enligt den operationstabell som föreskrivs av de mexikanska officiella riktlinjerna (NOM-032-SSA2-2002). Alla behandlingsdoser administrerades under övervakning av en medlem av studiegruppen. För små barn krossades tabletter, blandades med vatten och matades med sked. Behandlade patienter observerades under 30 minuter efter intag av läkemedlen. De som kräktes den första dosen återbehandlades med en liknande dos, men de som kräktes igen uteslöts från studien.

Den första delen av studien utformades för att övervaka de parasitologiska (clearance av primära blodinfektioner) och kliniska svar på båda behandlingsscheman. Behandlade patienter planerades för undersökning dag 2, 3, 7, 14, 21 och 28. Den andra delen av studien var utformad för att övervaka förekomsten av återfall genom månatliga parasitologiska och kliniska undersökningar, upp till 12 månader.

Patienterna uppmuntrades att komma tillbaka till våra anläggningar, eller vid behov kontakta oss via mobiltelefon (de flesta patienter eller deras föräldrar hade en mobiltelefon), om de kände sig sjuka någon gång under uppföljningsperioden eller hade några frågor om studie. Deltagare som inte kunde återvända till våra lokaler besöktes i sina hem för att ge behandling, klinisk revision och blodprovstagning. Ett snabbt diagnostiskt test (RDT) (OptiMAL©) applicerades på symtomatiska patienter i deras hem. De tjocka utstrykarna från symtomatiska patienter med negativ RDT analyserades samma dag och i fallet med bekräftande av en återkommande P. vivax-episod behandlades patienterna omedelbart med T14.

Vid behov implementerades ett flexibelt schema för att underlätta patienternas uppföljning t.ex. om patienter efter den första SD-kuren inte var hemma på dag 3 besöktes de på dag 4, dag 7 ± 1 och dag 14 ± 2, och för alla patienter (under ISD eller T14) på ​​dag 21 ± 2 och så vidare . Två tjocka och tunna blodfilmer och ett blodprov impregnerat i filterpapper (Whatman #2) preparerades vid varje planerat eller extra besök (hos symtomatiska patienter). Patienter med axillär temperatur ≥37,5 ◦C behandlades symtomatiskt med paracetamol (10 mg/kg).

(se Resultatmått)

Parasitologisk diagnos. Tjocka och tunna blodfilmer färgades med 10 % lösning av Giemsa-färgämne under fem minuter. De tjocka utstrykarna undersöktes under ett ljusmikroskop med oljedoppning 100 × av erfarna mikroskopister. Asexuella och sexuella parasitdensiteter bestämdes genom att räkna antalet parasiter mot 200 vita blodkroppar (WBC) (eller 500 WBC, om mindre än 10 parasiter påträffades i 200 WBC-fält), med antagande om 7 000 WBC/μl blod (Gonzalez-Ceron) et al., 2005).

Anti-P. vivax blod stadier IgG-antikroppar genom ELISA. För att avslöja P. vivax återkommande blodinfektioner; asymtomatisk och/eller låg parasitemi som inte detekterats med mikroskopi, mättes immunglobuliner isotyp G (IgG) mot naturliga P. vivax-proteiner i blodstadiet i alla prover som erhållits från månad 1 till 12. Från varje patient eluerades blodprover bevarade i filterpapper i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och testades i en ELISA för att detektera IgG-antikroppar mot P. vivax blodstadier (Gonzalez-Ceron et al., 1991). Sero-omvandling eller förändringar i antikroppstitrar analyserades. Ett brytvärde på 0,25 av absorbansvärdet bestämdes tidigare.

Molekylär diagnos . Molekylär diagnos har visat sig vara mycket känslig i olika malariadrabbade regioner (Rubio et al., 1999). Alla uppföljande blodprover från dag 2, 3, 7, 14, ~21 och ~28, och de prover som tagits under 12-månadersuppföljningen med misstanke om nyligen genomförd malariainfektion, vilket tyder på en ökning av antikroppar anti-P. vivax IgG (genom ELISA ), utsattes för molekylär diagnos. Sex stansar av 5 mm torkat blod i filterpapper skars och användes för att extrahera DNA med hjälp av QIAamp® DNA Blood Mini Kit (QIAGEN, Tyskland) enligt tillverkarens instruktioner. DNA:t suspenderades i 50 ul vatten. För att detektera P. vivax RNA ribosomala 18S subenhetsgenen (18ssrRNA).

Genotypning av primära och återkommande P. vivax-infektioner (Gonzalez-Ceron et al., 2013). För att jämföra P. vivax-genotyper av primära och sekundära episoder, användes polymeraskedjereaktionsrestriktion Fragment Length Polymorphism (PCR-RFLP) för att analysera cspr-, msp3α- och msp3β-genmarkörer. Homogeniteten av P. vivax genotyper bland grupper undersöktes med ett Fishers exakta test (α = 0,05).

Dataanalys Alla parasitologiska och kliniska data från varje patient som avslutade de övervakade behandlingarna (under 28 dagar och under 12 månader) analyserades med STATA v12. För att utesluta möjligheten att en subdos orsakade försening av parasitrensning, användes kroppsvikterna som registrerades på dag 0 för att beräkna doser av CQ och PQ som gavs till patienter och jämfördes med det som var nödvändigt för deras kroppsvikt.

Parasitologisk och klinisk bot av den primära blodinfektionen:

Klassificering av behandlingsresultat som indikeras av metoderna för övervakning av antimalarialäkemedels effekt (WHO, 2009)

Tidig behandlingssvikt (ETF)

• farosignaler eller allvarlig malaria på dag 1, 2 eller 3 i närvaro av parasitemi;
• parasitemi på dag 2 högre än på dag 0, oberoende av axillär temperatur;
• parasitemi på dag 3 med axillär temperatur ≥ 37,5 ºC;
• parasitemi på dag 3 ≥ 25 % av antalet på dag 0. Sen behandlingssvikt (LTF)
• Farotecken eller allvarlig malaria i närvaro av parasitemi någon dag mellan dag 4 och dag 28 hos patienter som tidigare inte uppfyllde något av kriterierna för tidig behandlingssvikt;
• Förekomst av parasitemi någon dag mellan dag 4 och dag 28 med axillär temperatur ≥ 37,5 ºC (eller feber i anamnesen) hos patienter som tidigare inte uppfyllde något av kriterierna för tidig behandlingssvikt.

Adekvat kliniskt och parasitologiskt svar (ACR)

- Frånvaro av parasitemi inom dag 7-28 utan någon TF-signal. För ACR-analysen inkluderades mikroskopiska parasitologiska resultat med och utan PCR-justering.

Fishers exakta test användes för att jämföra två eller flera oberoende proportioner: kön, förekomst av symtom, fördelning av P. vivax genotyp, PCR-positivitet och parasitpersistens dag 2 och 3 mellan behandlingsgrupperna. Wilcoxons rangsummetest användes för icke-parametriska jämförelser: ålder, asexuell och sexuell parasitemi, läkemedelsdoser, dagar med symtom och axiell temperatur. Alla signifikanstester var tvåsvansade och P-värden < 0,05 ansågs vara statistiskt signifikanta.

Återkommande blodinfektioner, när de upptäcktes under 12 månaders uppföljning, registrerades såväl som att patienterna gick i pension. Effektiviteten beräknades som procenten av det ackumulerade antalet patienter utan P. vivax-blodinfektion (första återkommande fallet) som upptäcktes vid varje provtagningsmånad, dividerat med det totala antalet patienter som följdes upp. Z-test användes för att bestämma skillnader i andelen patienter eller prover med en återkommande infektion. För att plotta den kumulativa incidensen av patienter med första recidiv i procent användes Kaplan-Meier feluppskattningar.

För att utvärdera det kliniska och parasitologiska resultatet på primär blodinfektion togs prover för dag 2. 3, 7, 14, 21 och 28 i ett flexibelt schema och för återkommande blodinfektioner fortsattes provtagningen varje månad upp till 12 månader. Blodprover från dag 2 till dag 28 analyserades genom mikroskopi av det tjocka utstryket och genom molekylär diagnos. Prover från patienter med symtom analyserades omedelbart och om en återkommande infektion upptäcktes räddades patienterna genom 14-dagarsbehandlingen. För att avslöja asymtomatiska infektioner analyserades alla andra prover inom 1-12 månader med mikroskopi och testade antikropps-IgG-titrar och endast de som misstänktes för en återkommande blodinfektion analyserades med molekylär diagnos.

Endast data från patienter som fullföljde de övervakade behandlingarna inkluderades i analysen. Parasitologiskt och kliniskt botande av den primära blodinfektionen: Analysen av svaret på behandlingen beaktade två utfall baserat på 1) det tidiga kliniska och parasitologiska resultatet utvärderades efter 2-3 dagar efter behandling, 2) och terapeutiskt misslyckande (TF) om det var kliniskt och/eller parasitologisk asexuell parasitpersistens eller återuppträdande inträffade inom 7-28 dagar. Ett adekvat kliniskt och parasitologiskt svar (ACPR) definierades som (1) frånvaro av parasitemi inom dagarna 7-28 utan någon TF-signal. För ACR-analysen inkluderades mikroskopiska parasitologiska resultat med och utan PCR-justering. Effektiviteten för eliminering av återfall visades genom den månatliga uppföljningen upp till ett år genom att detektera närvaron av symtom och/eller parasiten i blodomloppet och P. vivax genotypmatchning av primära och återkommande infektioner.

Klassificering av behandlingsresultat för återkommande blodinfektioner som upptäckts efter 28 dagar och upp till 12 månader:

Återkommande blodinfektion. Återkommande symtomatisk eller asymtomatisk asexuell parasitemi, efter eller under behandlingsadministrering, kan orsakas av ett återfall eller en ny infektion. Ett återfall orsakas av ett hypnozoit, vilande stadium i levern som finns hos andelen patienter efter en primär blodinfektion.

Kön, ålder på patienter med återkommande blodinfektioner anges, liksom tidpunkt, parasitemi, serologiska förändringar, parasitgenotyp, närvaro eller frånvaro av symtom. Andelen återkommande episoder som matchade genotypen eller inte jämfördes för båda behandlingsregimerna och statistisk signifikans beräknades (p-värde).

ÖVERVAKNING, FORMAT OCH PROCEDURER FÖR ATT UNDVIKA SAKNADE DATA:

Patientregister: alla dokument om en patient hade dess namn, by (och hemnummer/adress) och den unika koden. PI övervakade regelbundet procedurerna för diagnos och patientrekrytering och följde upp på lab och fält. Registerprocedurerna och informationsbladen per patient förvaras i individuella filer av PI:

• Blankett 1: Patient diagnostiserad med P. vivax: patientens namn, ålder, kön, eventuell medicin som tagits före diagnos, patientadress, levande, asexuell och sexuell parasitemi per µl blod. Namn på handledaren om det är en patient under 18 år.
• Formulär 2: Informerat samtycke: en patient har uppfyllt inklusionskriterierna, den ombads att delta genom att använda det informerade samtycket från studien, godkänd av den etiska kommittén vid National Institute for Public Health i Mexiko.
• Blankett 3: ett kliniskt journalblad fylldes i med patientens namn och unika kod, kliniska data från den symtomatiska patienten som närvaro av feber (inom 48 timmar), huvudvärk, myalgi, artralgi, symtom som tyder på paroxysm, klinisk revision för sökningen av erytem, ​​gulsot och patientens vikt samlades in.
• Blankett 4: uppföljningsblad implementerades också för att registrera vid alla besök (schemalagda och oplanerade) datum för patientintervju, kliniska symtom och blodprovstagning. I händelse av frånvaro av patienten hemma, antecknades det i formuläret och besöket bokades om till nästa dag (vid uppföljning inom 28 dagar, men kunde ombokas inom en vecka, eller för månatlig uppföljning (inom månad ett till månad 12).
• En databas med Excel-datablad uppdaterades regelbundet (varje månad) och dubbelkollade med labbet, fältteamet och PI för att förhindra förlust av information och felaktigheter.

• Objektglasen och andra prover levererades till laboratoriet inslagna i ett papper med patientens unika kod, insamlingsdatum. Varje vardag var det mottagning av samma laborant för att kolla in alla provkoder och datum med format per patient. Eftersom informationen ständigt reviderades, löstes eventuella inkonsekvenser av prover, både labb- och fältteam. Ett av två objektglas med tjockt och tunt utstryk per gång per patient preparerades och skickades regelbundet till malarialaboratoriet vid National Institute for Diagnosis and Epidemiological Reference-Mexico (regelbundet varje månad), de levererades personligen av PI samt insamling av resultat och eventuella förfrågningar om provets kod och resultat reviderades och löstes. I slutet av studien samlades alla prover in av PI och i händelse av inkonsekvenser korsades prover mellan mikroskopister från de två institutionerna, dessa procedurer samordnades av PI.

  • En kopia av uppföljningsformuläret förvarades hemma hos patienten. Datakontroller, källdataverifiering för att bedöma noggrannheten: Standarddriftsprocedurer för att hantera registeroperationer och analysaktiviteter, såsom patientrekrytering, datainsamling, datahantering, dataanalys, rapportering för negativa händelser, etc.

Personalen som var involverad i detta projekt hade specifika uppgifter, och PI övervakade regelbundet alla olika aktiviteter på laboratoriet och fältpersonalen i studien. För varje rekryterad patient fanns ett schema för uppföljning och besöksdatum programmerade (en kopia tillhandahölls till varje patient), och när det var möjligt var patientens eller förälders mobiltelefon användbar för att varna en eller två tidigare dagar vid nästa besöks ankomst.

Fältteam: består av två personer, en läkare och en biolog. Provmottagning i labbet: gjordes av samma tekniker under hela studien, separera objektglasen från filterpapperet och leverera och/eller konservera proverna.

Mikroskopister: högutbildad erfaren personal, en som kontrollerar prover från symtomatiska patienter före rekrytering. En annan mikroskopist undersökte objektglasen från studien och prioriterade dessa prover från patienter under uppföljning och kliniskt misstänkta. Efter undersökningen koncentrerades objektglasen av labhandledaren och förvarades av PI.

Provstorlek som krävs för att visa en effekt: WHO:s rekommendationer för utvärdering av malariabehandling i Amerika följdes, men begränsades av antalet patienter med inklusionskriterier som accepterade att delta under 2-årsperioden. Projektet förlängdes också till nio månader.

Data eller prover med oklar information kasserades. De inkluderades inte i analysen, för att undvika att patienten förlorades implementerades ett flexibelt schema på plats för saknade patienter. Patientpensionering (omfattar frivillig eller ofrivillig pensionering, eller protokollöverträdelse). Patienten själv eller patientens handledare kan dra sig tillbaka från studien när som helst, eller PI pensionerar patienten om;

1. Förekomst av någon samtidig sjukdom
2. Detektering av blandad Plasmodium-arter infektion
3. Administrering av andra anti-malariamedel eller extra doser av behandling under uppföljning
4. Patienten vill inte fortsätta
5. Bli gravid
6. Fick ofullständig övervaka behandling
7. Andra negativa effekter: allvarliga allergier, förekomst av annan sjukdom av ett smittämne
8. Förvandlas till svår malaria
9. Får räddningsbehandling