Effectiviteit van malariabehandeling in Mexico (EMTM)

Malaria is in Mexico in pre-eliminatiestatus (Rodriguez et al., 2011; WHO, 2012) de lokale overdracht van Plasmodium falciparum is sinds 2000 onderbroken en de overdracht van P. vivax, de enige veroorzaker in het land, is teruggebracht tot zeer weinig hotspots (Ministerie van Volksgezondheid - Mexico, 1995-2005, Pan American Health Organization (PAHO), 2008, WHO, 2012).

Cloroquine (CQ) en primaquine (PQ) worden sinds 1940 gebruikt voor de behandeling van P. vivax bloed- en leverinfecties in de meest getroffen gebieden wereldwijd (Coatney, 1963). P. vivax die resistent is tegen CQ wordt sinds het einde van de jaren '80 echter progressief gerapporteerd in verschillende geografische regio's (Baird 1995). Chloroquine, niet langer aanbevolen als monotherapie WHO, 2010), toegediend (25 mg / kg lichaamsgewicht) gedurende drie opeenvolgende dagen (10, 10 en 5 mg / kg lichaamsgewicht) in combinatie met PQ (0,25 - 0,75 mg / kg lichaamsgewicht) gedurende 14 dagen, wordt nog steeds gebruikt in gebieden waar parasieten gevoelig zijn (White, 1998; WHO, 2010). Het 14-daagse regime geneest effectief primaire bloedinfecties en voorkomt terugval bij ten minste 90% van de patiënten (Galappaththy et al., 2007).

In Mexico wordt CQ in combinatie met PQ sinds de jaren 50 van de vorige eeuw gebruikt als de standaardbehandeling voor P. vivax-malaria. De PQ-behandeling wordt echter vaak niet voltooid vanwege ongewenste bijwerkingen zoals maagklachten. Op moeilijk bereikbare plaatsen kunnen de verlengde intervallen tussen bloedafname, parasitologische diagnose en behandeling van patiënten wel 3-4 weken duren. Om het risico op overdracht te verkleinen, werden bij patiënten met koorts in afgelegen gebieden daarom bloed afgenomen en onmiddellijk behandeld met een enkelvoudige dosis van 10 mg CQ en 0,75 mg PQ/kg lichaamsgewicht en, pas na bevestiging door microscopie, een intermitterend enkelvoudig dosisregime ( ISD) werd toegediend (Mendez et al., 1994; Channon et al., 2003; NOM-032-SSA2-2002).

De eerste enkele gecombineerde CQ-PQ wordt nog steeds toegediend en verwacht wordt dat het bloedparasieten zal elimineren, aangezien PQ parasieten kan vernietigen die overleven door het effect van CQ [Murphy et al., 1991), en de herhaalde toediening van ISD was bedoeld om recidieven van parasitemie te onderdrukken. (Mendez et al., 1994). De effectiviteit ervan is echter niet geëvalueerd.

Beoordeling en monitoring van de effectiviteit van de geïmplementeerde behandelingsstrategieën zijn nodig om vooruitgang te boeken in de richting van de eliminatie van malaria in de regio (malERA, 2011).

Methodologie Deze studie werd goedgekeurd door de Ethical Review Committee van het National Institute of Public Health (INSP), Mexico. Geïnformeerde toestemming werd verkregen van alle patiënten en de voogden van patiënten jonger dan 18 jaar.

De studie volgde het in vivo testprotocol van de Wereldgezondheidsorganisatie (WHO) voor het monitoren van resistentie tegen malariamedicijnen. Aangezien vroege recidieven kunnen optreden na 17 dagen post-primaire bloedinfectie, werden patiënten voor de klaring van de primaire bloedinfectie gevolgd gedurende ≈dag 28 en vanaf één maand tot 12 maanden om de eliminatie van terugval te controleren. Waar nodig werd een flexibel schema geïmplementeerd om de follow-up van patiënten te vergemakkelijken en het verlies van patiënten tot een minimum te beperken, zoals door anderen werd gesuggereerd (Ruebush et al., 2003).

Studie site. De studie werd uitgevoerd in de gemeente Tapachula en omliggende gemeenschappen in het zuiden van Chiapas, Mexico, grenzend aan Guatemala. De rekrutering van patiënten vond plaats in de diagnosefaciliteit van het Regionaal Centrum voor Volksgezondheidsonderzoek-INSP (CRISP) in Tapachula City, waar mensen met koorts die op zoek zijn naar een diagnose en behandeling van malaria, gratis diensten krijgen.

Steekproefgrootte. Er werd een minimale steekproefomvang van deelnemers per groep verwacht, zoals aangegeven door de Wereldgezondheidsorganisatie voor klinische studies in Amerika ((WHO, 2009; PAHO, 2010). Het totale aantal patiënten dat tijdens de onderzoeksperiode werd ingeschreven, werd echter bepaald door het aantal gevallen met de diagnose P. vivax dat aan de inclusiecriteria voldeed en werd geaccepteerd om deel te nemen.

Patiënt inschrijving. Een symptomatische patiënt werd gedefinieerd als een persoon die koorts of twee andere malariasymptomen vertoonde. Patiënten werden gerekruteerd van februari 2008 tot oktober 2009 volgens de inclusie- en exclusiecriteria (zie geschiktheidscriteria). Ingeschreven patiënten werden gerandomiseerd om ofwel gecombineerde CQ- en PQ-medicatie te ontvangen in ISD- of T14-schema's, maar patiënten die in Tapachula City en omgeving woonden, kregen de voorkeur om T14 te ontvangen om dagelijkse supervisie over de behandeling te vergemakkelijken. Op dezelfde dag van diagnose en voorafgaande behandeling (dag 0; datum geannoteerd), werden patiënten onderzocht op axiale temperatuur in graden Celsius (°C), lichaamsgewicht (in kg), zwelling van de milt en de aanwezigheid van klinische symptomen binnen de voorgaande 48 dagen. h zoals koorts, hoofdpijn, myalgie en artralgie. Tekenen van erytheem en geelzucht werden bepaald op de dag van inschrijving. Voor parasitologische en moleculaire analyse werd capillair bloed verzameld door middel van vingerprikken om respectievelijk dunne en dikke uitstrijkjes te maken en filterpapier te impregneren (Whatman #2). Andere demografische gegevens werden verzameld met behulp van een vragenlijst, b.v. leeftijd, geslacht, eerdere inname van chloroquine en primaquine en malaria-infecties, enz.

Behandeling en opvolging van de patiënt. De aanbevolen dosis voor één enkele dosis bestond uit 10 mg/kg CQ-fosfaat en 0,75 mg/kg primaquine. Patiënten onder ISD waren volgens schema om een ​​enkele dosis in te nemen op dag 0, 30, 60, 180, 210 en 240. Aan de andere kant omvatte de optimale dosis van T14 25 mg/kg CQ toegediend over een periode van 3 dagen (10 mg/kg op dag 0 en 1 en 5 mg/kg op dag 2) en PQ van 0,25 mg/kg /dag gedurende 14 dagen (WHO, 2010). Beide behandelingsregimes werden echter aangepast aan de leeftijd van de patiënt volgens de operationele tabel voorgeschreven door de Mexicaanse officiële richtlijnen (NOM-032-SSA2-2002). Alle behandelingsdoses werden toegediend onder supervisie van een lid van het onderzoeksteam. Voor kleine kinderen werden tabletten geplet, gemengd met water en met een lepel gevoerd. Behandelde patiënten werden gedurende 30 minuten na inname van de medicijnen geobserveerd. Degenen die de eerste dosis braken, werden opnieuw behandeld met een vergelijkbare dosis, maar degenen die opnieuw braken, werden uitgesloten van het onderzoek.

Het eerste deel van de studie was opgezet om de parasitologische (primaire klaring van bloedinfecties) en klinische reacties op beide behandelingsschema's te monitoren. Behandelde patiënten waren gepland voor onderzoek op dag 2, 3, 7, 14, 21 en 28. Het tweede deel van de studie was opgezet om het optreden van recidieven te monitoren door middel van maandelijkse parasitologische en klinische onderzoeken, tot 12 maanden.

Patiënten werden aangemoedigd om terug te komen naar onze faciliteiten, of indien nodig contact met ons op te nemen via de mobiele telefoon (de meeste patiënten of hun ouders hadden een mobiele telefoon), als ze zich op enig moment tijdens de follow-upperiode ziek voelden of vragen hadden over de studie. Deelnemers die niet naar onze faciliteiten konden terugkeren, werden thuis bezocht voor behandeling, klinische revisie en bloedafname. Bij symptomatische patiënten thuis werd een snelle diagnostische test (RDT) (OptiMAL©) toegepast. De dikke uitstrijkjes van symptomatische patiënten met negatieve RDT werden dezelfde dag geanalyseerd en in het geval dat een terugkerende P. vivax-episode werd bevestigd, werden patiënten onmiddellijk behandeld met T14.

Indien nodig werd een flexibel schema geïmplementeerd om de follow-up van patiënten te vergemakkelijken, b.v. als patiënten na het eerste SD-regime niet thuis waren op dag 3, werden ze bezocht op dag 4, dag 7 ± 1 en dag 14 ± 2, en voor alle patiënten (onder ISD of T14) op dag 21 ± 2 enzovoort . Bij elk gepland of extra bezoek (bij symptomatische patiënten) werden twee dikke en dunne bloedfilms en een bloedmonster geïmpregneerd in filtreerpapier (Whatman #2) gemaakt. Patiënten met okseltemperaturen ≥37,5 ◦C werden symptomatisch behandeld met paracetamol (10 mg/kg).

(zie Uitkomstmaten)

Parasitologische diagnose. Dikke en dunne bloedfilms werden gekleurd met 10% oplossing van Giemsa-kleurstof gedurende vijf minuten. De dikke uitstrijkjes werden onderzocht onder een lichtmicroscoop met olie-immersie 100 x door ervaren microscopisten. Dichtheden van aseksuele en seksuele parasieten werden bepaald door het aantal parasieten te tellen tegen 200 witte bloedcellen (WBC) (of 500 WBC, als er minder dan 10 parasieten werden aangetroffen in 200 WBC-velden), uitgaande van 7.000 WBC/μl bloed (Gonzalez-Ceron et al., 2005).

Anti-P. vivax bloedstadia IgG-antilichamen door ELISA. Om terugkerende bloedinfecties van P. vivax te ontdekken; asymptomatisch en/of lage parasitairemie niet gedetecteerd door microscopie, werden immunoglobulinen isotype G (IgG) tegen natieve P. vivax bloedstadium-eiwitten gemeten in alle monsters verkregen van maand 1 tot 12. Van elke patiënt werden bloedmonsters bewaard in filtreerpapier geëlueerd in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en getest in een ELISA om IgG-antilichamen tegen bloedstadia van P. vivax te detecteren (Gonzalez-Ceron et al., 1991). Seroconversie of veranderingen in antilichaamtiters werden geanalyseerd. Eerder werd een afkapwaarde van 0,25 van de absorptiewaarde bepaald.

Moleculaire diagnose. Het is aangetoond dat moleculaire diagnose erg gevoelig is in verschillende door malaria aangetaste regio's (Rubio et al., 1999). Alle vervolgbloedmonsters van Dag 2, 3, 7, 14, ~21 en ~28, en die monsters genomen tijdens de follow-up van 12 maanden met verdenking van recente malaria-infectie, gesuggereerd door een toename van antilichaam anti-P. vivax IgG (door ELISA), werden onderworpen aan moleculaire diagnose. Zes stansen van 5 mm gedroogd bloed in filtreerpapier werden gesneden en gebruikt om DNA te extraheren met behulp van de QIAamp® DNA Blood Mini Kit (QIAGEN, Duitsland) volgens de instructies van de fabrikant. Het DNA werd gesuspendeerd in 50 µl water. Om het gen voor de ribosomale 18S-subeenheid van P. vivax RNA (18ssrRNA) te detecteren.

Genotypering van primaire en recidiverende P. vivax-infecties (Gonzalez-Ceron et al., 2013). Om P. vivax- genotypen van primaire en secundaire episodes te vergelijken, werd Polymerase chain reaction-restriction Fragment Length Polymorphism (PCR-RFLP) gebruikt om cspr-, msp3α- en msp3β-genmarkers te analyseren. De homogeniteit van genotypen van P. vivax tussen groepen werd onderzocht met een Fisher's exact-test (α = 0,05).

Gegevensanalyse Alle parasitologische en klinische gegevens van elke patiënt die de behandelingen onder toezicht voltooide (gedurende 28 dagen en gedurende 12 maanden) werden geanalyseerd met behulp van STATA v12. Om de mogelijkheid uit te sluiten dat een subdosis een vertraging in de klaring van de parasiet veroorzaakte, werden de lichaamsgewichten geregistreerd op dag 0 gebruikt om de doses CQ en PQ die aan patiënten werden gegeven te berekenen en te vergelijken met wat nodig was voor hun lichaamsgewicht.

Parasitologische en klinische genezing van de primaire bloedinfectie:

Classificatie van behandelingsresultaten zoals aangegeven door de bewakingsmethoden voor de werkzaamheid van antimalariamedicijnen (WHO, 2009)

Vroeg falen van de behandeling (ETF)

• gevaarsverschijnselen of ernstige malaria op dag 1, 2 of 3 in aanwezigheid van parasitemie;
• parasitemie op dag 2 hoger dan op dag 0, ongeacht okseltemperatuur;
• parasitemie op dag 3 met okseltemperatuur ≥ 37,5 ºC;
• parasitemie op dag 3 ≥ 25% van de telling op dag 0. Laat falen van de behandeling (LTF)
• Tekenen van gevaar of ernstige malaria bij aanwezigheid van parasitemie op elke dag tussen dag 4 en dag 28 bij patiënten die eerder niet voldeden aan een van de criteria voor vroegtijdig falen van de behandeling;
• Aanwezigheid van parasitemie op elke dag tussen dag 4 en dag 28 met okseltemperatuur ≥ 37,5 ºC (of voorgeschiedenis van koorts) bij patiënten die niet eerder voldeden aan een van de criteria voor vroegtijdig falen van de behandeling.

Adequate klinische en parasitologische respons (ACR)

- Afwezigheid van parasitemie binnen dagen 7-28 zonder enig TF-signaal. Voor de ACR-analyse werden microscopische parasitologische resultaten opgenomen met en zonder PCR-aanpassing.

Fisher's exact-test werd gebruikt om twee of meer onafhankelijke proporties te vergelijken: geslacht, aanwezigheid van symptomen, verdeling van P. vivax-genotype, PCR-positiviteit en persistentie van parasieten op dag 2 en 3 tussen behandelingsgroepen. De Wilcoxon rank sum-test werd gebruikt voor niet-parametrische vergelijkingen: leeftijd, aseksuele en seksuele parasietmie, medicijndoses, dagen van symptomen en axiale temperatuur. Alle significantietoetsen waren tweezijdig en P-waarden < 0,05 werden als statistisch significant beschouwd.

Terugkerende bloedinfecties, wanneer ontdekt tijdens de follow-up van 12 maanden, werden geregistreerd, evenals de patiënten die met pensioen gingen. De effectiviteit werd berekend als het percentage van het geaccumuleerde aantal patiënten zonder P. vivax-bloedinfectie (eerste recidiverende zaak) gedetecteerd in elke maand van bemonstering, gedeeld door het totale aantal patiënten dat werd opgevolgd. Z-test werd gebruikt om verschillen te bepalen in het aantal patiënten of monsters met een terugkerende infectie. Om de cumulatieve incidentie van patiënten met een eerste recidief in procenten uit te zetten, werden de Kaplan-Meier-faalschattingen gebruikt.

Om de klinische en parasitologische uitkomst van primaire bloedinfectie te evalueren, werden monsters genomen voor dagen 2, 3, 7, 14, 21 en 28 in een flexibel schema en voor terugkerende bloedinfecties werden tot 12 maanden lang elke maand monsters genomen. Bloedmonsters van dag 2 tot dag 28 werden geanalyseerd door microscopie van het dikke uitstrijkje en door moleculaire diagnose. Monsters van patiënten met symptomen werden onmiddellijk geanalyseerd en als een terugkerende infectie werd gedetecteerd, werden patiënten gered door de 14-daagse behandeling. Om asymptomatische infecties aan het licht te brengen, werden alle andere monsters binnen 1-12 maanden geanalyseerd door microscopie en geteste antilichaam-IgG-titers en alleen die monsters die verdacht werden van een terugkerende bloedinfectie werden getest door middel van moleculaire diagnose.

Alleen gegevens van patiënten die de supervisiebehandelingen hebben voltooid, zijn in de analyse opgenomen. Parasitologische en klinische genezing van de primaire bloedinfectie: bij de analyse van de respons op de behandeling werden twee uitkomsten beschouwd op basis van 1) de vroege klinische en parasitologische uitkomst werd geëvalueerd na 2-3 dagen na de behandeling, 2) en therapeutisch falen (TF) indien klinische en/of parasitologische persistentie of terugkeer van aseksuele parasieten vond plaats binnen 7-28 dagen. Een adequate klinische en parasitologische respons (ACPR) werd gedefinieerd als (1) afwezigheid van parasitemie binnen dagen 7-28 zonder enig TF-signaal. Voor de ACR-analyse werden microscopische parasitologische resultaten opgenomen met en zonder PCR-aanpassing. De effectiviteit voor de eliminatie van terugval werd aangetoond door de maandelijkse follow-up tot één jaar door de aanwezigheid van symptomen en/of de parasiet in de bloedbaan te detecteren en de P. vivax-genotype-matching van primaire en recidiverende infecties.

Classificatie van behandelingsresultaten voor terugkerende bloedinfecties die langer dan 28 dagen en tot 12 maanden worden gedetecteerd:

Terugkerende bloedinfectie. Het opnieuw optreden van symptomatische of asymptomatische aseksuele parasitemie, na of tijdens toediening van de behandeling, kan het gevolg zijn van een terugval of een nieuwe infectie. Een terugval wordt veroorzaakt door een hypnozoiet, een slapend stadium in de lever dat aanwezig is bij een deel van de patiënten na een primaire bloedinfectie.

Het geslacht, de leeftijd van patiënten met recidiverende bloedinfecties worden aangegeven, evenals de timing, parasitemie, serologische veranderingen, genotype van de parasiet, aan- of afwezigheid van symptomen. Het aandeel recidiverende episodes dat al dan niet overeenkwam met het genotype werd vergeleken voor beide behandelingsregimes en de statistische significantie werd berekend (p-waarde).

TOEZICHT, FORMATEN EN PROCEDURES OM ONTBREKENDE GEGEVENS TE VOORKOMEN:

Patiëntenregistratie: alle documenten over een patiënt hadden de naam, het dorp (en huisnummer/adres) en de unieke code. De PI hield regelmatig toezicht op de procedures voor diagnose en werving en follow-up van patiënten in het laboratorium en in het veld. De registratieprocedures en informatiebladen per patiënt worden door de PI in individuele dossiers bijgehouden:

• Formulier 1: Patiënt gediagnosticeerd met P. vivax: naam van de patiënt, leeftijd, geslacht, eventueel ingenomen medicatie vóór de diagnose, adres van de patiënt, levende, aseksuele en seksuele parasietmie per µl bloed. Naam van de tutor in het geval dat het een patiënt onder de 18 jaar is.
• Formulier 2: Geïnformeerde toestemming: één patiënt voldeed aan de inclusiecriteria, hij werd gevraagd om deel te nemen door gebruik te maken van de geïnformeerde toestemming van het onderzoek, goedgekeurd door de ethische commissie van het Nationaal Instituut voor Volksgezondheid in Mexico.
• Formulier 3: een klinisch dossier werd ingevuld met de naam van de patiënt en de unieke code, klinische gegevens van de symptomatische patiënt als aanwezigheid van koorts (binnen 48 uur), hoofdpijn, myalgie, artralgie, symptomen die wijzen op paroxysme, klinische revisie voor het zoeken van erytheem, geelzucht en het gewicht van de patiënt werden verzameld.
• Formulier 4: follow-upblad werd ook geïmplementeerd om bij alle bezoeken (gepland en ongepland) de datum van het patiëntinterview, de klinische symptomen en het verzamelen van bloedmonsters te registreren. In geval van afwezigheid van de patiënt thuis, werd dit op het formulier geannoteerd en werd het bezoek opnieuw gepland voor de volgende dag (in geval van follow-up binnen 28 dagen, maar kon binnen een week opnieuw worden gepland, of voor maandelijkse follow-up (binnen maand één tot maand 12).
• Een database met Excel-gegevensbladen werd regelmatig bijgewerkt (elke maand) en dubbel gecontroleerd met het lab, het veldteam en PI om verlies van informatie en onnauwkeurigheden te voorkomen.

• De objectglaasjes en andere monsters werden bij het laboratorium afgeleverd, gewikkeld in papier met een unieke code voor de patiënt en de datum van afname. Elke doordeweekse dag was er een receptie door dezelfde laborant om alle staalcodes en data met formaten per patiënt na te kijken. Omdat de informatie voortdurend werd herzien, werd elke inconsistentie opgelost door monsters van zowel laboratorium- als veldteams. Een van de twee objectglaasjes met dik en dun uitstrijkje per keer per patiënt werd geprepareerd en regelmatig naar het malarialaboratorium van het National Institute for Diagnosis and Epidemiological Reference-Mexico gestuurd (regelmatig elke maand). verzameling van resultaten en eventuele vragen over de code en resultaten van het monster werden herzien en opgelost. Aan het einde van het onderzoek werden alle monsters verzameld door de PI en in geval van inconsistenties werden monsters gekruist tussen microscopisten van de twee instellingen, deze procedures werden gecoördineerd door de PI.

  • Een kopie van het follow-upformulier werd bij de patiënt thuis bewaard. Gegevenscontroles, brongegevensverificatie om de juistheid te beoordelen: standaardwerkwijzen voor registerbewerkingen en analyseactiviteiten, zoals patiëntenwerving, gegevensverzameling, gegevensbeheer, gegevensanalyse, rapportage van ongewenste voorvallen, enz.

Het personeel dat bij dit project betrokken was, had specifieke taken en de PI hield regelmatig toezicht op alle verschillende activiteiten bij het laboratorium- en veldpersoneel van het onderzoek. Voor elke gerekruteerde patiënt was er een follow-upschema en geprogrammeerde bezoekdata (één exemplaar werd aan elke patiënt verstrekt), en indien mogelijk was de mobiele telefoon van de patiënt of ouder nuttig om een ​​of twee dagen eerder te waarschuwen voor de aankomst van het volgende bezoek.

Veldteam: bestaande uit twee mensen, een clinicus en een bioloog. Monsterontvangst in het laboratorium: werd gedaan door dezelfde technicus tijdens het hele onderzoek, scheidde de objectglaasjes van het filtreerpapier en leverde en/of bewaart de monsters.

Microscopisten: hoogopgeleid ervaren personeel, één die monsters van symptomatische patiënten controleert voorafgaand aan rekrutering. Een andere microscopist bekeek de dia's van het onderzoek en gaf prioriteit aan die monsters van patiënten die werden opgevolgd en klinisch verdacht waren. Na het onderzoek werden de objectglaasjes geconcentreerd door de labo-supervisor en bewaard door de PI.

Steekproefgrootte die nodig is om een ​​effect aan te tonen: de aanbevelingen van de WHO voor de evaluatie van malariabehandelingen in Amerika werden gevolgd, maar beperkt door het aantal patiënten met inclusiecriteria dat accepteerde om deel te nemen gedurende de periode van 2 jaar. Ook werd het project verlengd tot negen maanden.

Gegevens of monsters met onduidelijke informatie werden weggegooid. Ze werden niet opgenomen in de analyse, om te voorkomen dat patiënten verloren gingen, werd ter plaatse een flexibel schema geïmplementeerd voor vermiste patiënten. Patiëntuittreding (omvat vrijwillige of onvrijwillige pensionering, of schending van het protocol). De patiënt zelf of de begeleider van de patiënt kan zich op elk moment terugtrekken uit het onderzoek, of de PI schrijft de patiënt terug als;

1. Aanwezigheid van een bijkomende ziekte
2. Detectie van infectie met gemengde Plasmodium-soorten
3. Toediening van andere antimalariamiddelen of extra doseringen tijdens de follow-up
4. Patiënt wil niet verder
5. Zwanger worden
6. Onvolledige supervisiebehandeling gekregen
7. Andere nadelige effecten: ernstige allergieën, aanwezigheid van een andere ziekte door een infectieus agens
8. Verander in ernstige malaria
9. Reddingsbehandeling ontvangen