墨西哥疟疾治疗的有效性 (EMTM)

墨西哥的疟疾处于消除前状态（Rodriguez 等人，2011 年；WHO，2012 年），自 2000 年以来，恶性疟原虫在当地的传播被阻断，该国唯一的病原体间日疟原虫的传播减少到热点很少（墨西哥卫生部，1995-2005 年，泛美卫生组织 (PAHO)，2008 年，世界卫生组织，2012 年）。

自 1940 年以来，氯喹 (CQ) 和伯氨喹 (PQ) 被用于治疗全球大部分受感染地区的间日疟原虫血液和肝脏感染（Coatney，1963 年）。 然而，自 80 年代末以来，在各个地理区域逐渐报道了对 CQ 具有抗性的间日疟原虫 (Baird 1995)。 氯喹，不再推荐作为单一疗法 WHO，2010 年），连续三天（10,10 和 5 mg / Kg 体重）与 PQ（0.25 - 0.75 mg /公斤体重）在 14 天内，仍在寄生虫易感地区使用（White，1998 年；WHO，2010 年）。 14 天的方案有效治愈原发性血液感染并防止至少 90% 的患者复发（Galappathy 等人，2007）。

在墨西哥，自上世纪 50 年代以来，CQ 联合 PQ 已被用作间日疟原虫疟疾的标准治疗方法。 然而，由于胃部不适等不良副作用，PQ 治疗常常无法完成。 在交通不便的地方，采血、寄生虫学诊断和患者治疗之间的间隔时间可能长达 3-4 周。 因此，为了降低传播风险，对偏远地区的发热患者进行了血液采样，并立即用单剂量 10 mg CQ 和 0.75 mg PQ/kg 体重进行治疗，并且只有在显微镜确认后，才采用间歇单剂量方案（ ISD) 进行管理（Mendez 等人，1994 年；Channon 等人，2003 年；NOM-032-SSA2-2002）。

第一个单一的组合 CQ-PQ 仍然被管理，并且预计它会消除血液寄生虫，因为 PQ 可能会破坏从 CQ 的影响中幸存下来的寄生虫 [Murphy et al., 1991]，并且 ISD 的重复管理旨在抑制寄生虫血症的复发（门德斯等人，1994 年）。 但是，其有效性尚未得到评估。

评估和监测已实施的治疗策略的有效性对于推进该地区消除疟疾是必要的（malERA，2011）。

方法 本研究经墨西哥国家公共卫生研究所 (INSP) 伦理审查委员会批准。 所有患者和 18 岁以下患者的监护人均获得知情同意。

该研究遵循世界卫生组织 (WHO) 用于监测抗疟药耐药性的体内测试方案。 由于在原发性血液感染后 17 天后可能会出现早期复发，为了清除原发性血液感染，对患者进行了约第 28 天和一个月至 12 个月的随访，以监测复发消除情况。 在需要时，实施灵活的时间表以促进患者的随访，并按​​照其他人的建议最大限度地减少患者流失（Ruebush 等人，2003 年）。

学习网站。 该研究在墨西哥恰帕斯州南部与危地马拉接壤的塔帕丘拉市和周边社区进行。 患者招募是在塔帕丘拉市公共卫生研究区域中心 (CRISP) 的诊断设施中进行的，寻求疟疾诊断和治疗的发热人员可获得免费服务。

样本大小。 正如世界卫生组织在美洲进行的临床研究（（WHO，2009 年；泛美卫生组织，2010 年）所示，预期每组参与者的最小样本量。 然而，研究期间入组的患者总数由诊断为间日疟原虫且符合纳入标准并接受参与的病例数决定。

患者登记。 有症状的患者被定义为出现发烧或其他两种疟疾症状的人。 根据纳入和排除标准（参见资格标准），患者于 2008 年 2 月至 2009 年 10 月招募。 入组患者随机接受 ISD 或 T14 方案中的 CQ 和 PQ 联合用药，但居住在 Tapachula 市及附近的患者更愿意接受 T14 以促进日常治疗监督。 在诊断和先前治疗给药的同一天（第 0 天；注释日期），检查患者的轴温（摄氏度）、体重（千克）、脾脏肿胀和前 48 天内是否存在临床症状h 如发热、头痛、肌痛和关节痛。 红斑和黄疸迹象在入组当天确定。 为了进行寄生虫学和分子分析，通过手指刺破收集毛细血管血，分别制备薄涂片和厚涂片并浸渍滤纸 (Whatman #2)。 其他人口统计数据是使用问卷收集的，例如 年龄、性别、既往氯喹和伯氨喹摄入量以及疟疾感染情况等。

患者治疗和随访。 单次剂量的推荐剂量包括 10 mg/kg 的 CQ 磷酸盐和 0.75 mg/kg 的伯氨喹。 ISD 下的患者计划在第 0、30、60、180、210 和 240 天服用单次剂量。 另一方面，T14 的最佳剂量包括在 3 天内施用 25 mg/kg 的 CQ（第 0 天和第 1 天为 10 mg/kg，第 2 天为 5 mg/kg）和 PQ 为 0.25 mg/kg /天在 14 天内（WHO，2010）。 然而，根据墨西哥官方指南 (NOM-032-SSA2-2002) 规定的手术表，两种治疗方案都根据患者的年龄进行了调整。 所有治疗剂量均在研究小组成员的监督下进行。 对于小孩，将药片压碎，与水混合并用勺子喂食。 在摄入药物后 30 分钟内观察接受治疗的患者。 那些第一次服药就呕吐的人接受了类似剂量的再次治疗，但再次呕吐的人被排除在研究之外。

研究的第一部分旨在监测两种治疗方案的寄生虫学（原发性血液感染清除）和临床反应。 接受治疗的患者被安排在第 2、3、7、14、21 和 28 天进行检查。 该研究的第二部分旨在通过长达 12 个月的每月寄生虫学和临床检查来监测复发的发生。

鼓励患者回到我们的设施，或在必要时通过手机与我们联系（大多数患者或他们的父母有手机），如果他们在随访期间的任何时间感到不适或对治疗有任何疑问学习。 无法返回我们设施的参与者在家中进行了访问，以提供治疗、临床修正和血液采样。 在家中对有症状的患者应用快速诊断测试 (RDT) (OptiMAL©)。 当天对 RDT 阴性的有症状患者的厚涂片进行了分析，在确认间日疟原虫复发的情况下，患者立即接受 T14 治疗。

在需要时，实施灵活的时间表以方便患者的跟进，例如如果第一个 SD 方案后的患者在第 3 天不在家，他们在第 4 天、第 7 ± 1 天和第 14 ± 2 天接受访问，所有患者（在 ISD 或 T14 下）在第 21 ± 2 天等等. 在每次预定或额外访问（有症状的患者）时准备两份厚薄的血膜和一份浸渍在滤纸中的血样（Whatman #2）。 腋窝温度≥37.5 ◦C 的患者使用扑热息痛 (10 mg/kg) 进行对症治疗。

（见成果措施）

寄生虫学诊断。 厚和薄的血膜用 10% 的吉姆萨着色剂溶液染色 5 分钟。 经验丰富的显微镜技术人员使用 100 倍油浸在光学显微镜下检查厚涂片。 假设 7,000 WBC/μl 血液（Gonzalez-Ceron），无性和有性寄生虫密度是通过计算 200 个白细胞（WBC）（或 500 WBC，如果在 200 WBC 视野中遇到的寄生虫少于 10 个）的寄生虫数量来确定的等人，2005 年）。

抗P。 通过 ELISA 对间日疟原虫血液 IgG 抗体进行分期。 发现间日疟原虫反复血液感染；无症状和/或显微镜未检测到低寄生虫血症，在第 1 至 12 个月获得的所有样本中测量了针对天然间日疟原虫血液阶段蛋白的免疫球蛋白同种型 G (IgG)。从每位患者身上，保存在滤纸中的血液样本被洗脱在磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 中并在 ELISA 中测试以检测针对间日疟原虫血液阶段的 IgG 抗体（Gonzalez-Ceron 等人，1991）。 分析了抗体滴度的血清转化或变化。 先前确定吸光度值的截止值为 0.25。

分子诊断。 分子诊断已被证明在受疟疾影响的不同地区非常敏感（Rubio 等，1999）。 第 2、3、7、14、~21 和 ~28 天的所有后续血液样本，以及在 12 个月期间采集的样本，怀疑最近感染了疟疾，这表明抗 P 抗体增加。 vivax IgG（通过 ELISA），进行分子诊断。 按照制造商的说明，使用 QIAamp® DNA Blood Mini Kit（QIAGEN，德国）在滤纸上切割六孔 5 毫米干血并用于提取 DNA。 将 DNA 悬浮在 50 µl 水中。 检测间日疟原虫核糖体18S亚基基因（18ssrRNA）。

对原发性和复发性间日疟原虫感染进行基因分型（Gonzalez-Ceron 等人，2013 年）。 为了比较初级和次级发作的间日疟原虫基因型，使用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性 (PCR-RFLP) 分析 cspr、msp3α 和 msp3β 基因标记。 通过 Fisher 精确检验 (α = 0.05) 检查组间间日疟原虫基因型的同质性。

数据分析 使用 STATA v12 分析每位完成监督治疗（28 天和 12 个月）的患者的所有寄生虫学和临床数据。 为了排除亚剂量导致寄生虫清除延迟的可能性，第 0 天记录的体重用于计算给予患者的 CQ 和 PQ 剂量，并与他们的体重所需的剂量进行比较。

原发性血液感染的寄生虫学和临床治愈：

抗疟药物疗效监测方法表明的治疗结果分类（WHO，2009）

早期治疗失败（ETF）

• 在存在寄生虫血症的第 1、2 或 3 天出现危险迹象或严重疟疾；
• 第 2 天的寄生虫血症高于第 0 天，与腋窝温度无关；
• 第 3 天出现寄生虫血症，腋温 ≥ 37.5 ºC；
• 第 3 天寄生虫血症 ≥ 第 0 天计数的 25%。晚期治疗失败 (LTF)
• 先前未达到任何早期治疗失败标准的患者在第 4 天至第 28 天之间的任何一天存在寄生虫血症的危险迹象或严重疟疾；
• 在先前未满足任何早期治疗失败标准的患者中，在第 4 天和第 28 天之间的任何一天出现寄生虫血症且腋温≥ 37.5 ºC（或有发热史）。

充分的临床和寄生虫反应 (ACR)

- 在没有任何 TF 信号的情况下，第 7-28 天内没有寄生虫血症。 对于 ACR 分析，显微镜寄生虫学结果包括有和没有 PCR 调整。

Fisher 精确检验用于比较两个或多个独立比例：性别、症状存在、间日疟原虫基因型分布、PCR 阳性和治疗组之间第 2 天和第 3 天的寄生虫持续存在。 Wilcoxon 秩和检验用于非参数比较：年龄、无性和有性寄生虫血症、药物剂量、症状天数和轴向温度。 所有显着性检验都是双尾的，P 值 < 0.05 被认为具有统计学意义。

在 12 个月的随访期间检测到的复发性血液感染以及退休的患者都会被登记。 有效性计算为在每个月的采样中检测到的无间日疟原虫血液感染（第一例复发病例）的累计患者数除以随访患者总数的百分比。 Z检验用于确定复发感染患者或样本比例的差异。 为了以百分比绘制首次复发患者的累积发生率，使用了 Kaplan-Meier 失败估计。

为了评估原发性血液感染的临床和寄生虫学结果，以灵活的时间表在第 2、3、7、14、21 和 28 天获取样本，对于复发性血液感染，每个月继续采集样本直至 12 个月。 从第 2 天到第 28 天的血样通过厚涂片显微镜检查和分子诊断进行分析。 立即分析有症状患者的样本，如果检测到复发性感染，则患者会通过 14 天的治疗获救。 为发现无症状感染，对 1-12 个月内的所有其他样本进行显微镜分析并测试抗体 IgG 滴度，只有那些疑似复发性血液感染的样本进行分子诊断。

分析中仅包括来自完成监督治疗的患者的数据。 原发性血液感染的寄生虫学和临床治愈：对治疗的反应分析考虑了两个结果，基于 1) 治疗后 2-3 天后评估早期临床和寄生虫学结果，2) 和治疗失败 (TF) 如果临床和/或寄生虫无性寄生虫持续存在或再现发生在 7-28 天内。 充分的临床和寄生虫反应 (ACPR) 定义为 (1) 在第 7-28 天内没有寄生虫血症，没有任何 TF 信号。 对于 ACR 分析，显微镜寄生虫学结果包括有和没有 PCR 调整。 通过检测症状的存在和/或血流中的寄生虫以及原发性和复发性感染的间日疟原虫基因型匹配，长达一年的每月随访证明了消除复发的有效性。

超过 28 天至 12 个月检测到的复发性血液感染的治疗结果分类：

反复血液感染。 有症状或无症状的无性寄生虫血症在治疗后或治疗期间复发，可由复发或新感染引起。 复发是由休眠体引起的，在原发性血液感染后，部分患者会出现休眠期。

指出了反复血液感染患者的性别、年龄，以及时间、寄生虫血症、血清学变化、寄生虫基因型、有无症状。 比较两种治疗方案与基因型匹配或不匹配的复发发作比例，并计算统计显着性（p 值）。

避免丢失数据的监督、格式和程序：

患者登记：关于患者的所有文件都有其姓名、村庄（和家庭号码/地址）和唯一代码。 PI 定期监督诊断和患者招募程序，并在实验室和现场进行跟进。 PI 将每位患者的登记程序和信息表保存在单独的文件中：

• 表 1：诊断为间日疟原虫的患者：患者姓名、年龄、性别、诊断前服用的任何药物、患者住址、活体、无性和性寄生虫血症每微升血液。 如果是 18 岁以下的患者，导师的姓名。
• 表2：知情同意书：1名患者符合纳入标准，使用墨西哥国家公共卫生研究所伦理委员会批准的研究知情同意书要求其参与。
• 表格 3：临床记录表填写患者姓名和唯一代码，有症状患者的临床数据如发热（48 小时内）、头痛、肌痛、关节痛、阵发性症状、临床修订以供搜索收集红斑、黄疸和患者体重。
• 表格 4：还实施了随访表，以在所有访问（计划和非计划）中记录患者面谈、临床症状和血液样本收集的日期。 如遇患者不在家，在表格中注明，改次日就诊（如28天内复诊，可改一周内，或每月复诊） （第一个月至第十二个月内）。
• Excel 数据表数据库定期（每月）更新，并与实验室、现场团队和 PI 进行双重检查，以防止信息丢失和不准确。

• 载玻片和其他样本被包裹在一张纸上，上面写有患者唯一代码、采集日期。 每个工作日都有同一个实验室技术人员接待，以检查所有样本代码和日期以及每个患者的格式。 随着信息的不断修订，任何不一致的地方都由实验室和现场团队的样本解决。 每位患者每次涂片厚涂和薄涂两张幻灯片中的一张准备好并定期发送到墨西哥国家诊断和流行病学参考研究所的疟疾实验室（每月定期），它们由 PI 亲自交付以及结果的收集以及有关样本代码和结果的任何查询都得到了修改和解决。 在研究结束时，所有样品均由 PI 收集，如果出现不一致，样品将在两个机构的显微镜师之间交叉，这些程序由 PI 协调。

  • 随访表的副本保存在患者家中。 数据检查、源数据验证以评估准确性：用于处理注册操作和分析活动的标准操作程序，例如患者招募、数据收集、数据管理、数据分析、不良事件报告等。

参与该项目的人员有特定的任务，PI 定期监督实验室和现场人员的所有不同活动。 对于每个招募的患者，都有一个时间表跟进和计划的访问日期（向每个患者提供一份副本），并且在可能的情况下，患者或父母的手机有助于在下次访问到来前一两天发出警告。

现场小组：由两人组成，一名临床医生和一名生物学家。 实验室中的样品接收：在整个研究过程中由同一位技术人员完成，将载玻片与滤纸分开，并交付和/或保存样品。

显微镜师：高技能的经验丰富的人员，一名在招募前检查有症状患者的样本。 其他显微镜师正在检查研究的幻灯片，优先考虑那些来自正在接受随访和临床可疑的患者的样本。 检查结束后，载玻片由实验室主管集中，由PI保管。

证明效果所需的样本量：遵循了 WHO 对美洲疟疾治疗评估的建议，但受到在 2 年期间接受参与的符合纳入标准的患者数量的限制。 该项目也延长至九个月。

信息不明确的数据或样本被丢弃。 他们不包括在分析中，为避免患者丢失，现场为失踪患者实施了灵活的时间表 患者退休（包括自愿或非自愿退休，或违反协议）。 患者本人或患者的导师可以随时退出研究，或者 PI 使患者退出，如果：

1. 存在任何伴随疾病
2. 检测混合疟原虫感染
3. 在随访期间服用其他抗疟药或额外剂量的治疗
4. 患者不想继续
5. 怀孕
6. 接受不完全督导治疗
7. 其他不良反应：严重过敏、传染原引起的其他疾病
8. 转为重症疟疾
9. 接受抢救治疗