Efficacia del trattamento della malaria in Messico (EMTM)

La malaria è in stato di pre-eliminazione in Messico (Rodriguez et al., 2011; WHO, 2012) la trasmissione locale di Plasmodium falciparum è stata interrotta dal 2000, e la trasmissione di P. vivax, l'unico agente eziologico nel paese, è ridotta a pochissimi punti caldi (Ministero della Salute - Messico, 1995-2005, Pan American Health Organization (PAHO), 2008, WHO, 2012).

Clorochina (CQ) e primachina (PQ) sono utilizzate dal 1940 per trattare le infezioni del sangue e del fegato da P. vivax nelle aree più colpite in tutto il mondo (Coatney, 1963). Tuttavia P. vivax resistente a CQ è stato progressivamente segnalato in varie regioni geografiche a partire dalla fine degli anni '80 (Baird 1995). Clorochina, non più raccomandata come monoterapia OMS, 2010), somministrata (25 mg/Kg di peso corporeo) per tre giorni consecutivi (10,10 e 5 mg/Kg di peso corporeo) in combinazione con PQ (0,25 - 0,75 mg/ kg di peso corporeo) per 14 giorni, è ancora utilizzato nelle regioni in cui i parassiti sono suscettibili (White, 1998; WHO, 2010). Il regime di 14 giorni cura efficacemente le infezioni ematiche primarie e previene le ricadute in almeno il 90% dei pazienti (Galappaththy et al., 2007).

In Messico, CQ combinato con PQ è stato utilizzato come trattamento standard per la malaria da P. vivax sin dagli anni '50 del secolo scorso. Tuttavia, il trattamento PQ spesso non viene completato a causa di effetti collaterali indesiderati come disturbi allo stomaco. In luoghi di difficile accesso, gli intervalli prolungati tra il prelievo di sangue, la diagnosi parassitologica e il trattamento dei pazienti potrebbero richiedere fino a 3-4 settimane. Quindi, per ridurre il rischio di trasmissione, i pazienti febbrili in aree remote sono stati sottoposti a prelievo di sangue e trattati immediatamente con una singola dose di 10 mg CQ e 0,75 mg PQ/kg di peso corporeo e, solo dopo la conferma microscopica, un regime a dose singola intermittente. ISD) (Mendez et al., 1994; Channon et al., 2003; NOM-032-SSA2-2002).

Il primo singolo CQ-PQ combinato è ancora somministrato e si prevede che eliminerà i parassiti del sangue poiché il PQ può distruggere i parassiti sopravvissuti all'effetto del CQ [Murphy et al., 1991), e la somministrazione ripetuta di ISD aveva lo scopo di sopprimere le recidive della parassitemia (Mendez et al., 1994). Tuttavia, la sua efficacia non è stata valutata.

La valutazione e il monitoraggio dell'efficacia delle strategie terapeutiche implementate sono necessari per avanzare verso l'eliminazione della malaria nella regione (malERA, 2011).

Metodologia Questo studio è stato approvato dal Comitato Etico di Revisione dell'Istituto Nazionale di Sanità Pubblica (INSP), Messico. Il consenso informato è stato ottenuto da tutti i pazienti e dai tutori dei pazienti di età inferiore ai 18 anni.

Lo studio ha seguito il protocollo di test in vivo dell'Organizzazione mondiale della sanità (OMS) per il monitoraggio della resistenza ai farmaci antimalarici. Poiché le recidive precoci possono verificarsi dopo 17 giorni dopo l'infezione ematica primaria, per la clearance dell'infezione ematica primaria, i pazienti sono stati seguiti per ≈Giorno 28 e da un mese fino a 12 mesi per monitorare l'eliminazione della recidiva. Quando richiesto, è stato implementato un programma flessibile per facilitare il follow-up dei pazienti e minimizzare la perdita di pazienti come suggerito da altri (Ruebush et al., 2003).

Sito di studio. Lo studio è stato condotto nel comune di Tapachula e nelle comunità circostanti nel sud del Chiapas, in Messico, al confine con il Guatemala. Il reclutamento dei pazienti è stato effettuato nella struttura di diagnosi presso il Centro regionale per la ricerca sulla salute pubblica-INSP (CRISP) nella città di Tapachula, dove le persone febbrili che cercano diagnosi e cure per la malaria ottengono servizi gratuiti.

Misura di prova. Era prevista una dimensione minima del campione di partecipanti per gruppo, come indicato dall'Organizzazione mondiale della sanità per gli studi clinici nelle Americhe ((WHO, 2009; PAHO, 2010). Tuttavia, il numero totale di pazienti arruolati durante il periodo di studio è stato determinato dal numero di casi con diagnosi di P. vivax che soddisfacevano i criteri di inclusione e hanno accettato di partecipare.

Arruolamento dei pazienti. Un paziente sintomatico è stato definito come una persona che presentava febbre o altri due sintomi di malaria. I pazienti sono stati reclutati da febbraio 2008 a ottobre 2009 seguendo i criteri di inclusione ed esclusione (vedi criteri di ammissibilità). I pazienti arruolati sono stati randomizzati per ricevere farmaci combinati CQ e PQ negli schemi ISD o T14, ma i pazienti che vivevano nella città di Tapachula e nelle vicinanze hanno preferito ricevere T14 per facilitare la supervisione quotidiana del trattamento. Lo stesso giorno della diagnosi e della precedente somministrazione del trattamento (giorno 0; data annotata), i pazienti sono stati esaminati per la temperatura assiale in gradi Celsius (°C), il peso corporeo (in kg), il gonfiore della milza e la presenza di sintomi clinici entro i precedenti 48 h come febbre, mal di testa, mialgia e artralgia. I segni di eritema e ittero sono stati determinati il ​​giorno dell'arruolamento. Per l'analisi parassitologica e molecolare, il sangue capillare è stato raccolto mediante puntura del dito per preparare rispettivamente strisci sottili e spessi e per impregnare le carte da filtro (Whatman n. 2). Altri dati demografici sono stati raccolti utilizzando un questionario, ad es. età, sesso, precedente assunzione di clorochina e primachina e infezioni da malaria, ecc.

Trattamento e follow-up del paziente. La dose raccomandata per una dose singola consisteva in 10 mg/kg di fosfato CQ e 0,75 mg/kg di primachina. I pazienti sottoposti a ISD dovevano assumere una singola dose nei giorni 0, 30, 60, 180, 210 e 240. D'altra parte, la dose ottimale di T14 comprendeva 25 mg/kg di CQ somministrati in un periodo di 3 giorni (10 mg/kg nei giorni 0 e 1 e 5 mg/kg il giorno 2) e PQ a 0,25 mg/kg /giorno per 14 giorni (WHO, 2010). Tuttavia, entrambi i regimi di trattamento sono stati adattati all'età dei pazienti secondo il tavolo operatorio prescritto dalle linee guida ufficiali messicane (NOM-032-SSA2-2002). Tutte le dosi di trattamento sono state somministrate sotto la supervisione di un membro del team dello studio. Per i bambini piccoli, le compresse venivano frantumate, mescolate con acqua e somministrate con il cucchiaio. I pazienti trattati sono stati osservati per 30 minuti dopo l'ingestione dei farmaci. Coloro che hanno vomitato la prima dose sono stati ritrattati con una dose simile, ma quelli che hanno vomitato di nuovo sono stati esclusi dallo studio.

La prima parte dello studio è stata progettata per monitorare le risposte parassitologiche (eliminazione dell'infezione del sangue primaria) e cliniche a entrambi i programmi di trattamento. I pazienti trattati sono stati programmati per l'esame nei giorni 2, 3, 7, 14, 21 e 28. La seconda parte dello studio è stata progettata per monitorare l'insorgenza di recidive mediante esami parassitologici e clinici mensili, fino a 12 mesi.

I pazienti sono stati incoraggiati a tornare nelle nostre strutture o, se necessario, a contattarci tramite telefono cellulare (la maggior parte dei pazienti o i loro genitori avevano un telefono cellulare), se si sentivano male in qualsiasi momento durante il periodo di follow-up o se avevano domande sul studio. I partecipanti impossibilitati a tornare nelle nostre strutture sono stati visitati nelle loro case per fornire cure, revisione clinica e prelievo di sangue. Un test diagnostico rapido (RDT) (OptiMAL©) è stato applicato a pazienti sintomatici presso le loro abitazioni. Gli strisci spessi dei pazienti sintomatici con RDT negativo sono stati analizzati lo stesso giorno e in caso di conferma di un episodio ricorrente di P. vivax, i pazienti sono stati immediatamente trattati con T14.

Quando richiesto, è stato implementato un programma flessibile per facilitare il follow-up dei pazienti, ad es. se i pazienti dopo il primo regime SD non erano a casa il Giorno 3, sono stati visitati il ​​Giorno 4, i Giorni 7 ± 1 e il Giorno 14 ± 2, e per tutti i pazienti (sotto ISD o T14) i Giorni 21 ± 2 e così via . Ad ogni visita programmata o extra (nei pazienti sintomatici) sono stati preparati due strisci di sangue spessi e sottili e un campione di sangue impregnato in carta da filtro (Whatman n. 2). I pazienti con temperature ascellari ≥37,5 ◦C sono stati trattati sintomaticamente con paracetamolo (10 mg/kg).

(vedi Misure di risultato)

Diagnosi parassitologica. Film di sangue spessi e sottili sono stati colorati con una soluzione al 10% di colorante Giemsa per cinque minuti. Gli spessi strisci sono stati esaminati al microscopio ottico mediante immersione in olio 100 × da microscopisti esperti. Le densità dei parassiti asessuati e sessuali sono state determinate contando il numero di parassiti rispetto a 200 globuli bianchi (WBC) (o 500 WBC, se sono stati rilevati meno di 10 parassiti in 200 campi WBC), assumendo 7.000 WBC/μl di sangue (Gonzalez-Ceron et al., 2005).

Anti-P. vivax sangue stadi anticorpi IgG mediante ELISA. Per scoprire infezioni del sangue ricorrenti da P. vivax; asintomatici e/o di bassa parassitemia non rilevata al microscopio, sono state misurate le immunoglobuline isotipo G (IgG) contro le proteine ​​native dello stadio sanguigno di P. vivax in tutti i campioni ottenuti dal mese 1 al 12. Da ciascun paziente sono stati eluiti campioni di sangue conservati in carta da filtro in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) e testato in ELISA per rilevare gli anticorpi IgG contro gli stadi ematici di P. vivax (Gonzalez-Ceron et al., 1991). Sono state analizzate la sieroconversione o le variazioni dei titoli anticorpali. In precedenza era stato determinato un valore di cut-off di 0,25 del valore di assorbanza.

Diagnosi molecolare. La diagnosi molecolare ha dimostrato di essere molto sensibile in diverse regioni colpite dalla malaria (Rubio et al., 1999). Tutti i campioni di sangue di follow-up dei giorni 2, 3, 7, 14, ~21 e ~28 e quei campioni prelevati durante il follow-up di 12 mesi con sospetto di recente infezione da malaria, suggerito da un aumento dell'anticorpo anti-P. vivax IgG (mediante ELISA ), sono stati sottoposti a diagnosi molecolare. Sei punzoni di 5 mm di sangue essiccato in carta da filtro sono stati tagliati e utilizzati per estrarre il DNA utilizzando il kit QIAamp® DNA Blood Mini (QIAGEN, Germania) seguendo le istruzioni del produttore. Il DNA è stato sospeso in 50 µl di acqua. Per rilevare il gene della subunità ribosomiale 18S dell'RNA di P. vivax (18ssrRNA).

Genotipizzazione delle infezioni primarie e ricorrenti da P. vivax (Gonzalez-Ceron et al., 2013). Per confrontare i genotipi di P. vivax degli episodi primari e secondari, è stato utilizzato il polimorfismo della lunghezza del frammento di restrizione della reazione a catena della polimerasi (PCR-RFLP) per analizzare i marcatori genici cspr, msp3α e msp3β. L'omogeneità dei genotipi di P. vivax tra i gruppi è stata esaminata mediante un test esatto di Fisher (α = 0,05).

Analisi dei dati Tutti i dati parassitologici e clinici di ciascun paziente che ha completato i trattamenti supervisionati (per 28 giorni e per 12 mesi) sono stati analizzati utilizzando STATA v12. Per scartare la possibilità che una sottodose causasse un ritardo nella clearance del parassita, i pesi corporei registrati al giorno 0 sono stati utilizzati per calcolare le dosi di CQ e PQ somministrate ai pazienti e confrontate con quelle necessarie per il loro peso corporeo.

Cura parassitologica e clinica dell'infezione primaria del sangue:

Classificazione degli esiti del trattamento come indicato dai metodi di sorveglianza dell'efficacia dei farmaci antimalarici (WHO, 2009)

Fallimento precoce del trattamento (ETF)

• segni di pericolo o malaria grave al giorno 1, 2 o 3 in presenza di parassitemia;
• parassitemia al giorno 2 maggiore rispetto al giorno 0, indipendentemente dalla temperatura ascellare;
• parassitemia al giorno 3 con temperatura ascellare ≥ 37,5 ºC;
• parassitemia al giorno 3 ≥ 25% del conteggio al giorno 0. Fallimento tardivo del trattamento (LTF)
• Segni di pericolo o malaria grave in presenza di parassitemia in qualsiasi giorno compreso tra il giorno 4 e il giorno 28 in pazienti che in precedenza non soddisfacevano nessuno dei criteri di fallimento precoce del trattamento;
• Presenza di parassitemia in qualsiasi giorno compreso tra il giorno 4 e il giorno 28 con temperatura ascellare ≥ 37,5 ºC (o anamnesi di febbre) in pazienti che in precedenza non soddisfacevano nessuno dei criteri di fallimento precoce del trattamento.

Adeguata risposta clinica e parassitologica (ACR)

- Assenza di parassitemia nei giorni 7-28 senza alcun segnale TF. Per l'analisi ACR, i risultati parassitologici microscopici sono stati inclusi con e senza aggiustamento PCR.

Il test esatto di Fisher è stato utilizzato per confrontare due o più proporzioni indipendenti: sesso, presenza di sintomi, distribuzione del genotipo di P. vivax, positività alla PCR e persistenza del parassita nei giorni 2 e 3 tra i gruppi di trattamento. Il test della somma dei ranghi di Wilcoxon è stato utilizzato per confronti non parametrici: età, parassitemia asessuale e sessuale, dosi di farmaci, giorni di sintomi e temperatura assiale. Tutti i test di significatività erano a due code e i valori P <0,05 sono stati considerati statisticamente significativi.

Sono state registrate infezioni del sangue ricorrenti, quando rilevate durante il follow-up di 12 mesi, così come i pazienti che andavano in pensione. L'efficacia è stata calcolata come la percentuale del numero accumulato di pazienti senza infezione ematica da P. vivax (primo caso ricorrente) rilevata in ogni mese di campionamento, divisa per il numero totale di pazienti seguiti. Il test Z è stato utilizzato per determinare le differenze nella proporzione di pazienti o campioni con un'infezione ricorrente. Per tracciare l'incidenza cumulativa del paziente con la prima recidiva in percentuale, sono state utilizzate le stime di fallimento di Kaplan-Meier.

Per valutare l'esito clinico e parassitologico sull'infezione del sangue primaria, i campioni sono stati prelevati per i giorni 2. 3, 7, 14, 21 e 28 in un programma flessibile e per le infezioni del sangue ricorrenti sono stati prelevati campioni ogni mese fino a 12 mesi. I campioni di sangue dal giorno 2 al giorno 28 sono stati analizzati mediante microscopia dello striscio spesso e mediante diagnosi molecolare. I campioni di pazienti con sintomi sono stati immediatamente analizzati e, se è stata rilevata un'infezione ricorrente, i pazienti sono stati salvati dal trattamento di 14 giorni. Per scoprire infezioni asintomatiche, tutti gli altri campioni entro 1-12 mesi sono stati analizzati al microscopio e testati titoli di anticorpi IgG e solo quelli sospettati di un'infezione del sangue ricorrente sono stati analizzati mediante diagnosi molecolare.

Nell'analisi sono stati inclusi solo i dati dei pazienti che hanno completato i trattamenti di supervisione. Cura parassitologica e clinica dell'infezione ematica primaria: l'analisi della risposta al trattamento ha considerato due esiti basati su 1) l'esito clinico e parassitologico precoce è stato valutato dopo 2-3 giorni post-trattamento, 2) e il fallimento terapeutico (TF) se clinico e/o la persistenza o ricomparsa del parassita asessuata parassitologica si è verificata entro 7-28 giorni. Un'adeguata risposta clinica e parassitologica (ACPR) è stata definita come (1) assenza di parassitemia entro i giorni 7-28 senza alcun segnale TF. Per l'analisi ACR, i risultati parassitologici microscopici sono stati inclusi con e senza aggiustamento PCR. L'efficacia per l'eliminazione delle ricadute è stata dimostrata dal follow-up mensile fino a un anno rilevando la presenza di sintomi e/o il parassita nel flusso sanguigno e la corrispondenza del genotipo di P. vivax delle infezioni primarie e ricorrenti.

Classificazione dei risultati del trattamento per infezioni del sangue ricorrenti rilevate oltre i 28 giorni e fino a 12 mesi:

Infezione del sangue ricorrente. La ricorrenza della parassitemia asessuata sintomatica o asintomatica, dopo o durante la somministrazione del trattamento, può essere prodotta da un episodio di recidiva o da una nuova infezione. Una ricaduta è causata da un ipnozoite, stadio dormiente nel fegato presente nella percentuale di pazienti s dopo un'infezione del sangue primaria.

Sono indicati il ​​sesso, l'età dei pazienti con infezioni del sangue ricorrenti, nonché la tempistica, la parassitemia, le alterazioni sierologiche, il genotipo del parassita, la presenza o l'assenza di sintomi. La proporzione di episodi ricorrenti corrispondenti o meno al genotipo è stata confrontata per entrambi i regimi di trattamento ed è stata calcolata la significatività statistica (valore p).

VIGILANZA, FORMATI E PROCEDURE PER EVITARE LA MANCANZA DEI DATI:

Registro dei pazienti: tutti i documenti relativi a un paziente riportavano il nome, il villaggio (e il numero/indirizzo di casa) e il codice univoco. Il PI supervisionava regolarmente le procedure per la diagnosi e il reclutamento dei pazienti e il follow-up in laboratorio e sul campo. Le procedure anagrafiche e le schede informative per paziente sono conservate in fascicoli individuali dal PI:

• Modulo 1: Paziente con diagnosi di P. vivax: nome del paziente, età, sesso, eventuali farmaci assunti prima della diagnosi, indirizzo del paziente, parassitemia vivente, asessuale e sessuale per µl di sangue. Nome del tutor nel caso si tratti di un paziente minore di 18 anni.
• Modulo 2: Consenso informato: un paziente ha soddisfatto i criteri di inclusione, è stato chiesto di partecipare utilizzando il consenso informato dello studio, approvato dal comitato etico dell'Istituto Nazionale di Sanità Pubblica in Messico.
• Modulo 3: è stata compilata una scheda clinica con nome e codice univoco del paziente, dati clinici del paziente sintomatico come presenza di febbre (entro 48 h), cefalea, mialgie, artralgie, sintomi indicativi di parossismo, revisione clinica per la ricerca di eritema, ittero e peso del paziente.
• Modulo 4: è stato inoltre implementato il foglio di follow-up per registrare a tutte le visite (programmate e non programmate) la data del colloquio con il paziente, i sintomi clinici e il prelievo dei campioni di sangue. In caso di assenza del paziente a casa, è stato annotato nel modulo e la visita è stata riprogrammata per il giorno successivo (in caso di follow-up entro 28 giorni, ma potrebbe essere riprogrammata entro una settimana, o per il follow-up mensile (entro il mese uno al mese 12).
• Un database di fogli dati Excel è stato regolarmente aggiornato (ogni mese) e ricontrollato con il laboratorio, il team sul campo e il PI per prevenire la perdita di informazioni e imprecisioni.

• I vetrini e gli altri campioni sono stati consegnati al laboratorio avvolti in una carta con codice univoco paziente, data di prelievo. Ogni giorno della settimana c'era un ricevimento da parte dello stesso tecnico di laboratorio per controllare tutti i codici dei campioni e le date con i formati per paziente. Poiché le informazioni venivano costantemente riviste, qualsiasi incoerenza è stata risolta da campioni sia di laboratorio che di team sul campo. Uno dei due vetrini con striscio spesso e sottile alla volta per paziente è stato preparato e inviato regolarmente al laboratorio di malaria presso l'Istituto nazionale per la diagnosi e il riferimento epidemiologico-Messico (regolarmente ogni mese), sono stati consegnati di persona dal PI così come la raccolta dei risultati e qualsiasi richiesta relativa al codice e ai risultati del campione è stata rivista e risolta. Alla fine dello studio tutti i campioni sono stati raccolti dal PI e in caso di incongruenze, i campioni sono stati incrociati tra microscopisti delle due istituzioni, queste procedure sono state coordinate dal PI.

  • Una copia del modulo di follow-up è stata conservata a casa del paziente. Controlli dei dati, verifica dei dati di origine per valutare l'accuratezza: procedure operative standard per affrontare le operazioni del registro e le attività di analisi, come il reclutamento dei pazienti, la raccolta dei dati, la gestione dei dati, l'analisi dei dati, la segnalazione di eventi avversi, ecc.

Il personale coinvolto in questo progetto aveva compiti specifici e il PI ha supervisionato regolarmente tutte le diverse attività del personale di laboratorio e di campo dello studio. Per ogni paziente reclutato c'era un programma di follow-up e le date della visita programmate (una copia è stata fornita a ciascun paziente), e quando possibile il cellulare del paziente o del genitore è stato utile per avvisare uno o due giorni prima dell'arrivo della visita successiva.

Field team: composto da due persone, un clinico e un biologo. Ricezione del campione in laboratorio: è stato effettuato dallo stesso tecnico durante tutto lo studio, separare i vetrini dalla carta da filtro e consegnare e/o conservare i campioni.

Microscopisti: personale esperto altamente qualificato, uno che controlla i campioni di pazienti sintomatici prima del reclutamento. Un altro microscopista stava esaminando i vetrini dello studio, dando la priorità a quei campioni di pazienti sottoposti a follow-up e clinicamente sospetti. Dopo l'esame, i vetrini sono stati concentrati dal supervisore di laboratorio e conservati dal PI.

Dimensione del campione necessaria per dimostrare un effetto: sono state seguite le raccomandazioni dell'OMS per la valutazione del trattamento della malaria nelle Americhe, ma limitate dal numero di pazienti con criteri di inclusione che hanno accettato di partecipare durante il periodo di 2 anni. Il progetto è stato inoltre esteso a nove mesi.

Dati o campioni con informazioni poco chiare sono stati scartati. Non sono stati inclusi nell'analisi, per evitare la perdita del paziente è stato implementato un programma flessibile in loco per i pazienti scomparsi Pensionamento del paziente (comprende il pensionamento volontario o involontario o violazione del protocollo). Il paziente stesso o il tutore del paziente possono ritirarsi dallo studio in qualsiasi momento, oppure il PI ritira il paziente se;

1. Presenza di qualsiasi malattia concomitante
2. Rilevazione di infezione da specie miste di Plasmodium
3. Somministrazione di altri antimalarici o dosi extra di trattamento durante il follow-up
4. Il paziente non desidera continuare
5. Rimanere incinta
6. Ha ricevuto un trattamento di supervisione incompleto
7. Altri effetti avversi: gravi allergie, presenza di altre malattie da un agente infettivo
8. Trasformarsi in una grave malaria
9. Ricevere un trattamento di salvataggio