Molekylär kultur för diagnos av pediatrisk sepsis (CHAMPIONS)

Nyfödda och barn får ofta antibiotika vid misstanke om sepsis. Sepsis har hög morbiditet och dödlighet hos nyfödda och barn. Upp till 50 % av barnen i Nederländerna ordineras minst en antibiotikakur under de första fyra levnadsåren. Postnatalt skrivs ofta antibiotika ut mot förmodade bakterieinfektioner på neonatal- och pediatriska avdelningar, men hos cirka 30 % av dessa patienter är bakterieinfektion inte påvisad.

Snabb diagnos av sepsis hos nyfödda och barn är problematisk eftersom kliniska tecken börjar subtila och är ospecifika. Guldstandarden för diagnos av bakteriell sepsis är en konventionell blododling. Tyvärr är bakterieodling tidskrävande (tid till resultat upp till 36-72 timmar) och saknar känslighet i denna population för sepsis. Av denna anledning behandlas barn och spädbarn med riskfaktorer för infektion eller kliniska tecken och symtom på infektion med antibiotika empiriskt vid initial sepsismisstanke, i väntan på resultat från den konventionella blododlingen. För närvarande får mer än 85 % av mycket för tidigt födda barn (graviditetsålder <30 veckor) antibiotika för risken för tidig sepsis (EOS) i Nederländerna och ungefär två tredjedelar utvärderas minst en gång för sen sepsis (LOS) ) . Även äldre barn ordineras ofta antibiotika empiriskt för förmodad sepsis, i väntan på resultat av blododlingen.

Det finns allt fler bevis för att, förutom antibiotikaresistens, användning av antibiotika under neonatalperioden och under barndomen förändrar mikrobiomet med en ökad risk för omedelbara och långsiktiga biverkningar, såsom ökad risk för astma, fetma, allergier och inflammatoriska effekter. tarmsjukdomar (IBD). För att undvika onödig behandling av icke-infekterade barn skulle ett tidigt, snabbt, känsligt och specifikt laboratorietest vara till hjälp för att vägleda läkare att bestämma när antibiotika ska avbrytas så snart som möjligt.

En annan teknik för att upptäcka neonatal sepsis snabbt och i ett tidigare skede jämfört med konventionell blododling är Molecular Culture (MC). MC är en snabb molekylärbaserad odlingsteknik som kan identifiera bakterier inom 4 timmar efter blodprovstagning. Kort sagt är MC en DNA-baserad profileringsteknik, som skiljer mellan bakteriearter baserat på artspecifika skillnader i 16S-23S rDNA interspacer (IS) region nukleotidlängd genom att använda fylumspecifika fluorescensmärkta polymeraskedjereaktion (PCR) primers. En standard MC-procedur består av två separata PCR. I den första PCR:n tillsätts två olika primrar, en primer som fluorescerande märker medlemmar av phyla Firmicutes, Actinobacter, Fusobacteria och Verrucomicrobia (FAFV), medan den andra primern märker medlemmar av Bacteroidetes phylum. I den andra PCR:n tillsätts en tredje märkt primer som riktar sig mot medlemmar av phylum Proteobacteria. Därefter kan dessa PCR-produkter amplifieras och DNA-fragment kan separeras baserat på deras nukleotidlängd. Så småningom kommer en typisk MC mikrobiell profil att skapas, bestående av en uppsättning färgmärkta toppar. Varje topp representerar en individuell bakteriell operationell taxonomisk enhet (OTU) beroende på nukleotidlängden av IS-fragmentet, längden på dessa toppar visar koncentrationen av denna speciella OTU, medan toppfärger ger information om den nuvarande phyla (FAFV, Bacteroidetes eller Proteobacteria) .

Vid bakteriell sepsis har en bakterie nått den annars sterila blodomloppet och orsakar sepsis som ett resultat av dysreglering av värdens immunsvar och/eller en reaktion av bakteriella endotoxiner. Både blododling och MC kan upptäcka bakterier och ge ett positivt resultat (ifall en bakterie har odlats) eller ett negativt resultat (ifall ingen bakterie upptäckts). Om testerna är positiva visar båda teknikerna också vilka bakterier som hittades, vilket kan användas för att ändra antibiotikakuren för att rikta in sig på den specifika odlade bakterien. Processen med MC kan dock avslutas inom 4 timmar, vilket är mycket kortare än inkubationstiden för guldstandardblodkulturen som är 36-72 timmar. När det inte finns någon sepsis (och därmed inga bakterier i blodomloppet) kommer MC att visa sig negativt även inom 4 timmar och kan därmed vägleda läkare att sluta antibiotika hos oinfekterade barn mycket snabbare jämfört med den konventionella blododlingen.

Blododlingar är fortfarande guldstandard, men antas generellt ha låg känslighet för diagnos av sepsis hos nyfödda och barn och är tidskrävande. Fall av sepsis kan missas av kulturer och ett mer känsligt diagnostiskt test som molekylära tester som MC kan vara användbart. Framsteg inom mikrobiell teknologi har lett till utvecklingen av snabba molekylära metoder som MC, som kan vara känsligare än odling. Flera nya molekylära tekniker, såsom kvantitativ PCR, brett spektrum av konventionell PCR och multiplex PCR, har studerats för att detektera neonatal sepsis. Dessa tekniker är dock riktade mot specifika arter vilket gör det omöjligt att upptäcka alla bakteriearter. Allt som inte är explicit sökt efter kommer alltså att missas. Däremot har MC förmågan att upptäcka varje bakterieart som kan orsaka bakteriell neonatal sepsis.

MC-tekniken är validerad för att detektera dessa patogena bakterier i kroppsvätskor. En serie artiklar som validerar alla aspekter av MC-tekniken har publicerats förra åren. Vidare används MC på sjukhus på intensivvårdsavdelningen för att upptäcka bakterier i annars sterila prover som blod, men även på prover från abscesser. En principiell studie på 39 nyfödda, misstänkta för EOS, av vilka ytterligare blodprover togs från både navelsträngar och från perifer flebotomi, visade att MC kunde detektera en patogen bakteriestam som med stor sannolikhet var den orsakande organismen för sepsis hos ett spädbarn som var kliniskt sjukt. Konventionell odling gav inga resultat för denna patient. 2 ytterligare MC-prover visade stammar som sannolikt var föroreningar hos spädbarn som var kliniskt välskötta, där konventionell odling förblev negativ. Inga andra avvikelser sågs. Denna studie visade också att MC på blodprover som spikats med vanliga bakteriestammar för neonatal sepsis, visade en mycket hög överensstämmelse med kvantitativ PCR som kontrolldiagnostik. .

Resultat från en annan studie som använder MC-tekniken för att upptäcka bakterier i mänsklig kroppsvätska är lovande. I denna studie samlades 66 prover in och testades med konventionell odling och MC. I 100 % av proverna med en positiv kultur var MC också positivt. I fem prover visade sig den konventionella kulturen vara negativ, medan MC var positiv. Fallhistorierna för dessa fem patienter erhölls och antydde att MC-fynden var mycket kliniskt relevanta och därför kan ha högre känslighet jämfört med konventionell blododling.

Sammanfattningsvis gör den snabba upptäckten MC potentiellt bättre rustad att vägleda kliniskt beslutsfattande för hantering av sepsis hos nyfödda och barn. Lämpligheten av MC i denna specifika population har dock inte undersökts tillräckligt. Därför bör en högkvalitativ studie utföras för att fastställa den diagnostiska noggrannheten av MC för sepsis hos nyfödda och barn och om denna teknik kan ersätta den konventionella blododlingen.