Kultura molekularna w diagnostyce sepsy u dzieci (CHAMPIONS)

Noworodki i dzieci często otrzymują antybiotyki z podejrzeniem sepsy. Sepsa charakteryzuje się wysoką zachorowalnością i śmiertelnością u noworodków i dzieci. Nawet 50% dzieci w Holandii przepisuje co najmniej jeden cykl antybiotyków w ciągu pierwszych 4 lat życia. Po urodzeniu na oddziałach noworodkowych i pediatrycznych często przepisuje się antybiotyki w przypadku podejrzenia zakażenia bakteryjnego, ale u około 30% tych pacjentek zakażenie bakteryjne nie zostało potwierdzone.

Szybkie rozpoznanie sepsy u noworodków i dzieci jest problematyczne, ponieważ objawy kliniczne zaczynają się subtelnie i są niespecyficzne. Złotym standardem w diagnostyce sepsy bakteryjnej jest konwencjonalny posiew krwi. Niestety posiew bakteryjny jest czasochłonny (czas na wynik do 36–72 godzin) i w tej populacji charakteryzuje się małą wrażliwością na sepsę. Z tego powodu dzieci i niemowlęta z czynnikami ryzyka zakażenia lub objawami klinicznymi i objawami zakażenia są leczone empirycznie antybiotykami po początkowym podejrzeniu sepsy, w oczekiwaniu na wyniki konwencjonalnego posiewu krwi. Obecnie w Holandii ponad 85% noworodków urodzonych przedwcześnie (wiek ciążowy < 30 tygodni) otrzymuje antybiotyki ze względu na ryzyko wystąpienia posocznicy o wczesnym początku (EOS), a około dwie trzecie jest przynajmniej raz badanych pod kątem sepsy o późnym początku (LOS). ) . Również starszym dzieciom często przepisuje się antybiotyki empirycznie w przypadku podejrzenia sepsy, w oczekiwaniu na wyniki posiewu krwi.

Istnieje coraz więcej dowodów na to, że oprócz oporności na antybiotyki, stosowanie antybiotyków w okresie noworodkowym i w dzieciństwie zmienia mikrobiom, zwiększając ryzyko natychmiastowych i długoterminowych działań niepożądanych, takich jak zwiększone ryzyko astmy, otyłości, alergii i stanów zapalnych. choroby jelit (IBD). Aby uniknąć niepotrzebnego leczenia niezakażonych dzieci, pomocne byłoby wczesne, szybkie, czułe i specyficzne badanie laboratoryjne, które pomogłoby klinicystom podjąć decyzję o jak najszybszym odstawieniu antybiotyków.

Inną techniką szybkiego i wcześniejszego wykrywania sepsy noworodków w porównaniu z konwencjonalnymi posiewami krwi jest hodowla molekularna (MC). MC to szybka technika hodowli molekularnej, która umożliwia identyfikację bakterii w ciągu 4 godzin od pobrania krwi. W skrócie, MC to technika profilowania oparta na DNA, polegająca na różnicowaniu gatunków bakterii na podstawie specyficznych dla gatunku różnic w długości nukleotydów regionu odstępnika 16S-23S rDNA (IS) przy użyciu specyficznych dla typu, znakowanych fluorescencyjnie starterów reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR). Standardowa procedura MC składa się z dwóch oddzielnych reakcji PCR. W pierwszej reakcji PCR dodaje się dwa różne startery, jeden starter fluorescencyjnie znakuje członków gromady Firmicutes, Actinobacter, Fusobacteria i Verrucomicrobia (FAFV), podczas gdy drugi starter znakuje członków typu Bacteroidetes. W drugiej reakcji PCR dodaje się trzeci znakowany starter skierowany do przedstawicieli typu Proteobacteria. Następnie te produkty PCR można amplifikować, a fragmenty DNA można rozdzielać na podstawie ich długości nukleotydów. Ostatecznie zostanie utworzony typowy profil drobnoustrojów MC, składający się z zestawu oznaczonych kolorami pików. Każdy pik reprezentuje indywidualną operacyjną jednostkę taksonomiczną bakterii (OTU) w zależności od długości nukleotydów fragmentu IS, długość tych pików pokazuje stężenie tego konkretnego OTU, podczas gdy kolory pików dostarczają informacji o obecnym typie (FAFV, Bacteroidetes lub Proteobacteria) .

W posocznicy bakteryjnej bakteria przedostała się do skądinąd sterylnego krwiobiegu, powodując sepsę w wyniku rozregulowania odpowiedzi immunologicznej gospodarza i/lub reakcji endotoksyn bakteryjnych. Zarówno posiew krwi, jak i MC mogą wykryć bakterie i dać wynik pozytywny (w przypadku wyhodowania bakterii) lub wynik negatywny (w przypadku, gdy nie wykryto bakterii). W przypadku pozytywnego wyniku obie techniki pokazują również, które bakterie wykryto, co można wykorzystać do zmiany schematu antybiotykoterapii tak, aby była ukierunkowana na tę konkretną hodowaną bakterię. Jednakże proces MC można zakończyć w ciągu 4 godzin, czyli znacznie krócej niż okres inkubacji złotego standardu posiewu krwi, który wynosi 36-72 godziny. Jeśli nie ma sepsy (a tym samym nie ma bakterii w krwiobiegu), wynik MC będzie negatywny również w ciągu 4 godzin, co może skłonić lekarzy do znacznie szybszego zaprzestania podawania antybiotyków u niezakażonych dzieci w porównaniu z konwencjonalnym posiewem krwi.

Posiewy krwi nadal stanowią złoty standard, jednak ogólnie przyjmuje się, że mają niską czułość w diagnostyce sepsy u noworodków i dzieci oraz są czasochłonne. Przypadki sepsy mogą zostać przeoczone w posiewach i przydatne mogą być bardziej czułe testy diagnostyczne, takie jak badania molekularne, takie jak MC. Postęp w technologii mikrobiologicznej doprowadził do opracowania szybkich metod molekularnych, takich jak MC, które mogą być bardziej czułe niż hodowla. W celu wykrycia posocznicy noworodków zbadano wiele nowych technik molekularnych, takich jak ilościowa PCR, konwencjonalna PCR o szerokim zakresie i multipleksowa PCR. Techniki te są jednak ukierunkowane na konkretne gatunki, co uniemożliwia wykrycie wszystkich gatunków bakterii. W ten sposób wszystko, co nie jest wyraźnie wyszukiwane, zostanie pominięte. Natomiast MC ma zdolność wykrywania każdego gatunku bakterii, który może powodować bakteryjną posocznicę noworodków.

Technika MC została zwalidowana pod kątem wykrywania tych patogennych bakterii w płynach ustrojowych. W ostatnich latach opublikowano serię artykułów potwierdzających wszystkie aspekty techniki MC. Co więcej, MC stosuje się w szpitalach na oddziałach intensywnej terapii do wykrywania bakterii w skądinąd sterylnych próbkach, takich jak krew, ale także w próbkach pobranych z ropni. Badanie potwierdzające zasadę przeprowadzone na 39 noworodkach podejrzanych o EOS, od których pobrano dodatkowe próbki krwi zarówno z pępowiny, jak i z upuszczania krwi obwodowej, wykazało, że MC był w stanie wykryć patogenny szczep bakteryjny, który z dużym prawdopodobieństwem był organizmem sprawczym posocznica u jednego niemowlęcia, które było klinicznie chore. Konwencjonalna hodowla nie dała żadnych wyników u tego pacjenta. Dwie dodatkowe próbki MC wykazały szczepy, które prawdopodobnie mogły powodować skażenie u niemowląt, które wyglądały dobrze klinicznie, jeśli konwencjonalna hodowla pozostała ujemna. Innych rozbieżności nie stwierdzono. Badanie to wykazało również, że MC w próbkach krwi wzbogaconych dominującymi szczepami bakteryjnymi powodującymi posocznicę noworodków wykazało bardzo dużą zgodność z ilościową PCR jako diagnostyką kontrolną. Potrzebne są większe badania, aby potwierdzić dokładność diagnostyczną, biorąc pod uwagę bardzo niską częstość występowania sepsy potwierdzonej w hodowli .

Wyniki innego badania wykorzystującego technikę MC do wykrywania bakterii w płynach ustrojowych człowieka są obiecujące. W tym badaniu pobrano 66 próbek i zbadano je za pomocą konwencjonalnej hodowli i MC. W 100% próbek z dodatnią kulturą, MC również było dodatnie. W pięciu próbach konwencjonalna kultura okazała się ujemna, podczas gdy MC była dodatnia. Uzyskano historie przypadków tych pięciu pacjentów i zasugerowano, że wyniki MC były wysoce istotne klinicznie, a zatem mogą charakteryzować się większą czułością w porównaniu z konwencjonalnymi posiewami krwi.

Podsumowując, szybkie wykrywanie sprawia, że ​​MC jest potencjalnie lepiej przygotowany do podejmowania decyzji klinicznych w leczeniu sepsy u noworodków i dzieci. Jednakże przydatność MC w tej konkretnej populacji nie została odpowiednio zbadana. Dlatego należy przeprowadzić wysokiej jakości badanie, aby określić dokładność diagnostyczną MC w kierunku sepsy u noworodków i dzieci oraz czy technika ta może zastąpić konwencjonalny posiew krwi.