Moleculaire cultuur voor de diagnose van pediatrische sepsis (CHAMPIONS)

Bij een vermoeden van sepsis krijgen pasgeborenen en kinderen vaak antibiotica. Sepsis heeft een hoge morbiditeit en mortaliteit bij pasgeborenen en kinderen. Tot 50% van de kinderen in Nederland krijgt in de eerste vier levensjaren minimaal één antibioticakuur voorgeschreven. Postnataal worden antibiotica vaak voorgeschreven voor vermoedelijke bacteriële infecties op neonatale en pediatrische afdelingen, maar bij ongeveer 30% van deze patiënten is bacteriële infectie niet bewezen.

Een snelle diagnose van sepsis bij pasgeborenen en kinderen is problematisch omdat de klinische symptomen subtiel beginnen en niet-specifiek zijn. De gouden standaard voor de diagnose van bacteriële sepsis is een conventionele bloedkweek. Helaas is het kweken van bacteriën tijdrovend (de tijd die nodig is om resultaat te bereiken kan oplopen tot 36-72 uur) en is het in deze populatie niet gevoelig voor sepsis. Om deze reden worden kinderen en zuigelingen met risicofactoren voor infectie of klinische tekenen en symptomen van infectie empirisch behandeld met antibiotica bij de eerste verdenking op sepsis, in afwachting van de resultaten van de conventionele bloedkweek. Momenteel krijgt in Nederland ruim 85% van de zeer prematuur geboren kinderen (zwangerschapsduur <30 weken) antibiotica vanwege het risico op early-onset sepsis (EOS) en wordt ongeveer tweederde minstens één keer onderzocht op late-onset sepsis (LOS). ). Ook oudere kinderen krijgen vaak empirisch antibiotica voorgeschreven voor vermoedelijke sepsis, in afwachting van de resultaten van de bloedkweek.

Er is steeds meer bewijs dat, afgezien van antibioticaresistentie, het gebruik van antibiotica in de neonatale periode en tijdens de kindertijd het microbioom verandert, met een verhoogd risico op directe en lange termijn nadelige effecten, zoals een verhoogd risico op astma, zwaarlijvigheid, allergieën en ontstekingsziekten. darmziekten (IBD). Om onnodige behandeling van niet-geïnfecteerde kinderen te voorkomen, zou een vroege, snelle, gevoelige en specifieke laboratoriumtest nuttig zijn om artsen te helpen beslissen wanneer ze zo snel mogelijk moeten stoppen met antibiotica.

Een andere techniek om neonatale sepsis snel en in een eerder stadium op te sporen vergeleken met conventionele bloedkweken is Moleculaire Cultuur (MC). MC is een snelle, moleculair gebaseerde kweektechniek die bacteriën binnen 4 uur na bloedafname kan identificeren. Kortom, MC is een op DNA gebaseerde profileringstechniek, waarbij onderscheid wordt gemaakt tussen bacteriesoorten op basis van soortspecifieke verschillen in de nucleotidelengte van het 16S-23S rDNA interspacer (IS) gebied door gebruik te maken van fylum-specifieke fluorescent gelabelde polymerasekettingreactie (PCR) primers. Een standaard MC-procedure bestaat uit twee afzonderlijke PCR's. In de eerste PCR worden twee verschillende primers toegevoegd, waarbij één primer op fluorescente wijze leden van de phyla Firmicutes, Actinobacter, Fusobacteria en Verrucomicrobia (FAFV) labelt, terwijl de tweede primer leden van de Bacteroidetes-phylum labelt. In de tweede PCR wordt een derde gelabelde primer toegevoegd die gericht is op leden van de phylum Proteobacteria. Vervolgens kunnen deze PCR-producten worden geamplificeerd en kunnen DNA-fragmenten worden gescheiden op basis van hun nucleotidelengte. Uiteindelijk zal een typisch MC-microbieel profiel worden gecreëerd, bestaande uit een reeks kleurgelabelde pieken. Elke piek vertegenwoordigt een individuele bacteriële operationele taxonomische eenheid (OTU), afhankelijk van de nucleotidelengte van het IS-fragment, waarbij de lengte van deze pieken de concentratie van deze specifieke OTU aantoont, terwijl piekkleuren informatie verschaffen over de huidige fyla (FAFV, Bacteroidetes of Proteobacteria) .

Bij bacteriële sepsis heeft een bacterie de anderszins steriele bloedbaan bereikt, waardoor sepsis ontstaat als gevolg van ontregeling van de immuunrespons van de gastheer en/of een reactie van bacteriële endotoxinen. Zowel de bloedkweek als de MC kunnen bacteriën detecteren en een positief resultaat geven (als er een bacterie is gekweekt) of een negatief resultaat (als er geen bacteriën zijn gedetecteerd). Als de tests positief zijn, laten beide technieken ook zien welke bacteriën zijn gevonden, wat kan worden gebruikt om het antibioticaregime te veranderen om zich op die specifieke gekweekte bacterie te richten. Het MC-proces kan echter binnen 4 uur worden voltooid, wat veel korter is dan de incubatietijd van de gouden standaardbloedcultuur, die 36-72 uur bedraagt. Als er geen sprake is van sepsis (en dus geen bacteriën in de bloedbaan), zal de MC ook binnen 4 uur negatief zijn en artsen er dus toe kunnen aanzetten om antibiotica bij niet-geïnfecteerde kinderen veel sneller te stoppen in vergelijking met de conventionele bloedkweek.

Bloedkweken zijn nog steeds de gouden standaard, maar algemeen wordt aangenomen dat ze weinig gevoelig zijn voor de diagnose van sepsis bij pasgeborenen en kinderen en tijdrovend zijn. Gevallen van sepsis kunnen door kweken worden gemist en een gevoeliger diagnostische test zoals moleculaire tests, aangezien de MC nuttig kan zijn. Vooruitgang in de microbiële technologie heeft geleid tot de ontwikkeling van snelle moleculaire methoden zoals MC, die mogelijk gevoeliger zijn dan cultuur. Meerdere nieuwe moleculaire technieken, zoals kwantitatieve PCR, conventionele PCR met breed bereik en multiplex PCR, zijn onderzocht om neonatale sepsis te detecteren. Deze technieken zijn echter gericht op specifieke soorten, waardoor het onmogelijk is om alle bacteriesoorten te detecteren. Alles waarnaar niet expliciet wordt gezocht, wordt dus gemist. MC heeft daarentegen het vermogen om elke bacteriesoort te detecteren die bacteriële neonatale sepsis kan veroorzaken.

De MC-techniek is gevalideerd om deze pathogene bacteriën in lichaamsvloeistoffen te detecteren. De afgelopen jaren is een reeks artikelen gepubliceerd waarin alle aspecten van de MC-techniek worden gevalideerd. Bovendien wordt MC in ziekenhuizen op de intensive care gebruikt om bacteriën te detecteren in verder steriele monsters zoals bloed, maar ook op monsters verkregen uit abcessen. Een proof-of-principle-studie bij 39 pasgeborenen, verdacht voor EOS, van wie aanvullende bloedmonsters werden genomen uit zowel de navelstreng als uit de perifere aderlatingen, toonde aan dat MC in staat was een pathogene bacteriestam te detecteren die zeer waarschijnlijk het veroorzakende organisme was sepsis bij één kind dat klinisch ziek was. Conventionele kweek leverde bij deze patiënt geen resultaat op. Twee extra MC-monsters toonden stammen aan die waarschijnlijk contaminanten waren bij zuigelingen en die er klinisch goed uitzagen, terwijl de conventionele kweek negatief bleef. Er werden geen andere afwijkingen gezien. Deze studie toonde ook aan dat MC op bloedmonsters die waren verrijkt met veel voorkomende bacteriestammen voor neonatale sepsis, een zeer hoge overeenkomst vertoonde met kwantitatieve PCR als controlediagnostiek. Grotere studies zijn nodig om de diagnostische nauwkeurigheid te bevestigen, gezien de zeer lage incidentie van door kweek bewezen sepsis. .

De resultaten van een ander onderzoek waarbij de MC-techniek wordt gebruikt om bacteriën in menselijk lichaamsvocht te detecteren, zijn veelbelovend. In dit onderzoek werden 66 monsters verzameld en getest door conventionele kweek en MC. In 100% van de monsters met een positieve kweek was de MC ook positief. In vijf monsters bleek de conventionele kweek negatief, terwijl de MC positief was. De casuïstiek van deze vijf patiënten werd verkregen en suggereerde dat de MC-bevindingen zeer klinisch relevant waren en dus mogelijk een hogere gevoeligheid hadden vergeleken met conventionele bloedkweken.

Samenvattend maakt de snelle detectie MC mogelijk beter toegerust om de klinische besluitvorming voor de behandeling van sepsis bij pasgeborenen en kinderen te begeleiden. De geschiktheid van MC in deze specifieke populatie is echter niet voldoende onderzocht. Daarom moet een onderzoek van hoge kwaliteit worden uitgevoerd om de diagnostische nauwkeurigheid van de MC voor sepsis bij pasgeborenen en kinderen te bepalen en of deze techniek de conventionele bloedkweek kan vervangen.