Cultura molecular para diagnóstico de sepse pediátrica (CHAMPIONS)

Recém-nascidos e crianças geralmente recebem antibióticos por suspeita de sepse. A sepse apresenta alta morbidade e mortalidade em recém-nascidos e crianças. Até 50% das crianças na Holanda recebem pelo menos um ciclo de antibióticos nos primeiros 4 anos de vida. No período pós-natal, os antibióticos são frequentemente prescritos para presumíveis infecções bacterianas nas enfermarias neonatais e pediátricas, mas em aproximadamente 30% destes pacientes a infecção bacteriana não é comprovada.

O diagnóstico rápido de sepse em recém-nascidos e crianças é problemático porque os sinais clínicos começam sutis e são inespecíficos. O padrão ouro para o diagnóstico de sepse bacteriana é a hemocultura convencional. Infelizmente, a cultura bacteriana é demorada (o tempo de obtenção do resultado é de 36 a 72 horas) e carece de sensibilidade nesta população para sepse. Por esse motivo, crianças e lactentes com fatores de risco para infecção ou sinais e sintomas clínicos de infecção são tratados com antibióticos empiricamente na suspeita inicial de sepse, aguardando o resultado da hemocultura convencional. Atualmente, mais de 85% dos bebês nascidos muito prematuros (idade gestacional <30 semanas) recebem antibióticos para o risco de sepse de início precoce (EOS) na Holanda e aproximadamente dois terços são avaliados pelo menos uma vez para sepse de início tardio (LOS). ). Além disso, crianças mais velhas recebem frequentemente prescrição de antibióticos empiricamente para suposta sepse, aguardando os resultados da hemocultura.

Há evidências crescentes de que, além da resistência aos antibióticos, o uso de antibióticos no período neonatal e durante a infância altera o microbioma com um risco aumentado de efeitos adversos imediatos e de longo prazo, como aumento do risco de asma, obesidade, alergias e doenças inflamatórias. doenças intestinais (DII). Para evitar tratamento desnecessário de crianças não infectadas, um teste laboratorial precoce, rápido, sensível e específico seria útil para orientar os médicos na decisão de quando descontinuar os antibióticos o mais rápido possível.

Outra técnica para detectar sepse neonatal de forma rápida e precoce em comparação à hemocultura convencional é a Cultura Molecular (CM). MC é uma técnica de cultura rápida de base molecular que é capaz de identificar bactérias dentro de 4 horas após a coleta de sangue. Em suma, MC é uma técnica de perfil baseada em DNA, diferenciando entre espécies bacterianas com base em diferenças específicas de espécies no comprimento de nucleotídeos da região interespaçador (IS) rDNA 16S-23S usando primers de reação em cadeia da polimerase (PCR) marcados com fluorescência específicos do filo. Um procedimento MC padrão consiste em dois PCRs separados. Na primeira PCR são adicionados dois primers diferentes, um primer marcando fluorescentemente membros dos filos Firmicutes, Actinobacter, Fusobacteria e Verrucomicrobia (FAFV), enquanto o segundo primer marca membros do filo Bacteroidetes. Na segunda PCR, um terceiro iniciador marcado é adicionado visando membros do filo Proteobacteria. Posteriormente, estes produtos de PCR podem ser amplificados e os fragmentos de DNA podem ser separados com base no comprimento dos seus nucleótidos. Eventualmente, um perfil microbiano MC típico será criado, consistindo em um conjunto de picos marcados por cores. Cada pico representa uma unidade taxonômica operacional bacteriana individual (OTU), dependendo do comprimento do nucleotídeo do fragmento IS, comprimento desses picos demonstrando a concentração desta OTU específica, enquanto as cores dos picos fornecem informações sobre os filos atuais (FAFV, Bacteroidetes ou Proteobacteria) .

Na sepse bacteriana, uma bactéria atingiu a corrente sanguínea estéril, causando sepse como resultado da desregulação da resposta imune do hospedeiro e/ou de uma reação de endotoxinas bacterianas. Tanto a hemocultura quanto o MC podem detectar bactérias e dar um resultado positivo (caso uma bactéria tenha sido cultivada) ou um resultado negativo (caso nenhuma bactéria tenha sido detectada). Caso os testes sejam positivos, ambas as técnicas também mostram quais bactérias foram encontradas, o que poderia ser usado para alterar o regime antibiótico para atingir aquela bactéria cultivada específica. No entanto, o processo de MC pode ser concluído em 4 horas, o que é muito mais curto do que o período de incubação da hemocultura padrão ouro, que é de 36 a 72 horas. Quando não há sepse (e, portanto, não há bactérias na corrente sanguínea), o CM também será negativo dentro de 4 horas e, portanto, poderá orientar os médicos a interromperem os antibióticos em crianças não infectadas muito mais rapidamente em comparação com a hemocultura convencional.

As hemoculturas ainda são o padrão-ouro, mas geralmente são consideradas como tendo baixa sensibilidade para o diagnóstico de sepse em recém-nascidos e crianças e são demoradas. Os casos de sepse podem passar despercebidos pelas culturas e um teste diagnóstico mais sensível, como testes moleculares como o MC, pode ser útil. Os avanços na tecnologia microbiana levaram ao desenvolvimento de métodos moleculares rápidos, como o MC, que podem ser mais sensíveis que a cultura. Múltiplas novas técnicas moleculares, como PCR quantitativo, PCR convencional de amplo espectro e PCR multiplex, foram estudadas para detectar sepse neonatal. No entanto, estas técnicas são dirigidas a espécies específicas, o que torna impossível detectar todas as espécies bacterianas. Assim, tudo o que não for explicitamente procurado será perdido. Em contraste, o MC tem a capacidade de detectar todas as espécies bacterianas que podem causar sepse bacteriana neonatal.

A técnica MC é validada para detectar essas bactérias patogênicas em fluidos corporais. Uma série de artigos validando todos os aspectos da técnica MC foram publicados nos últimos anos. Além disso, o MC está sendo usado em hospitais na unidade de terapia intensiva para detectar bactérias em amostras estéreis, como sangue, mas também em amostras obtidas de abscessos. Um estudo de prova de princípio em 39 neonatos, suspeitos de EOS, dos quais amostras de sangue adicionais foram coletadas de ambos os cordões umbilicais, bem como de flebotomia periférica, mostrou que MC foi capaz de detectar uma cepa bacteriana patogênica que era altamente provável o organismo causador de sepse em uma criança que estava clinicamente doente. A cultura convencional não produziu nenhum resultado para este paciente. Duas amostras adicionais de MC mostraram cepas que provavelmente eram contaminantes em bebês com boa aparência clínica, onde a cultura convencional permaneceu negativa. Nenhuma outra discrepância foi observada. Este estudo também mostrou que MC em amostras de sangue que foram enriquecidas com cepas bacterianas prevalentes para sepse neonatal, mostraram uma concordância muito alta com PCR quantitativo como diagnóstico de controle. Estudos maiores são necessários para corroborar a precisão do diagnóstico, dada a incidência muito baixa de sepse comprovada por cultura .

Os resultados de outro estudo que utilizou a técnica MC para detectar bactérias em fluidos corporais humanos são promissores. Neste estudo foram coletadas 66 amostras e testadas por cultura convencional e MC. Em 100% das amostras com cultura positiva, o MC também foi positivo. Em cinco amostras, a cultura convencional revelou-se negativa, enquanto a MC foi positiva. Os históricos de casos desses cinco pacientes foram obtidos e sugeriram que os achados de CM eram altamente relevantes clinicamente e, portanto, podem ter maior sensibilidade em comparação com a hemocultura convencional.

Em resumo, a detecção rápida torna o MC potencialmente mais bem equipado para orientar a tomada de decisões clínicas para o manejo da sepse em recém-nascidos e crianças. No entanto, a adequação do MC nesta população específica não foi investigada adequadamente. Portanto, um estudo de alta qualidade deve ser realizado para determinar a acurácia diagnóstica do CM para sepse em neonatos e crianças e se esta técnica pode substituir a hemocultura convencional.