Molekylær kultur til diagnosticering af pædiatrisk sepsis (CHAMPIONS)

Nyfødte og børn får ofte antibiotika ved mistanke om sepsis. Sepsis har høj morbiditet og dødelighed hos nyfødte og børn. Op til 50 % af børnene i Holland får ordineret mindst én antibiotikakur i de første 4 leveår. Postnatalt ordineres der ofte antibiotika til formodede bakterielle infektioner på neonatale og pædiatriske afdelinger, men hos cirka 30 % af disse patienter er bakteriel infektion ikke påvist.

Hurtig diagnosticering af sepsis hos nyfødte og børn er problematisk, fordi kliniske tegn starter subtile og er uspecifikke. Guldstandarden for diagnosticering af bakteriel sepsis er en konventionel blodkultur. Desværre er bakteriekultur tidskrævende (tid til resultat op til 36-72 timer) og mangler følsomhed i denne population for sepsis. Af denne grund behandles børn og spædbørn med risikofaktorer for infektion eller kliniske tegn og symptomer på infektion med antibiotika empirisk ved indledende mistanke om sepsis, afventende resultater af den konventionelle blodkultur. I øjeblikket modtager mere end 85 % af meget for tidligt fødte spædbørn (svangerskabsalder <30 uger) antibiotika for risikoen for tidlig sepsis (EOS) i Holland, og cirka to tredjedele vurderes mindst én gang for sen-debut sepsis (LOS). ). Også ældre børn får ofte ordineret antibiotika empirisk mod formodet sepsis, afventende resultater af blodkulturen.

Der er stigende evidens for, ud over antibiotikaresistens, at brugen af ​​antibiotika i den neonatale periode og i barndommen ændrer mikrobiomet med en øget risiko for umiddelbare og langsigtede bivirkninger, såsom øget risiko for astma, fedme, allergier og inflammatoriske sygdomme. tarmsygdomme (IBD). For at undgå unødvendig behandling af ikke-inficerede børn vil en tidlig, hurtig, følsom og specifik laboratorietest være nyttig til at vejlede klinikere til at beslutte, hvornår de skal seponere antibiotika så hurtigt som muligt.

En anden teknik til at opdage neonatal sepsis hurtigt og på et tidligere stadium sammenlignet med konventionel blodkultur er Molecular Culture (MC). MC er en hurtig molekylærbaseret dyrkningsteknik, der er i stand til at identificere bakterier inden for 4 timer efter blodprøvetagning. Kort sagt er MC en DNA-baseret profileringsteknik, der differentierer mellem bakteriearter baseret på artsspecifikke forskelle i 16S-23S rDNA interspacer (IS) region nukleotidlængde ved at bruge phylum-specifikke fluorescensmærkede polymerasekædereaktion (PCR) primere. En standard MC-procedure består af to separate PCR'er. I den første PCR tilføjes to forskellige primere, en primer, der fluorescerende mærker medlemmer af phyla Firmicutes, Actinobacter, Fusobacteria og Verrucomicrobia (FAFV), hvorimod den anden primer mærker medlemmer af Bacteroidetes phylum. I den anden PCR tilsættes en tredje mærket primer målrettet mod medlemmer af phylum Proteobacteria. Efterfølgende kan disse PCR-produkter amplificeres, og DNA-fragmenter kan separeres baseret på deres nukleotidlængde. Til sidst vil en typisk MC mikrobiel profil blive skabt, bestående af et sæt farvemærkede toppe. Hver top repræsenterer en individuel bakteriel operationel taksonomisk enhed (OTU) afhængigt af nukleotidlængden af ​​IS-fragmentet, længden af ​​disse toppe viser koncentrationen af ​​denne særlige OTU, hvorimod topfarver giver information om den nuværende phyla (FAFV, Bacteroidetes eller Proteobacteria) .

Ved bakteriel sepsis har en bakterie nået den ellers sterile blodbane, hvilket forårsager sepsis som følge af dysregulering af værtens immunrespons og/eller en reaktion af bakterielle endotoksiner. Både blodkultur og MC kan påvise bakterier og give et positivt resultat (i tilfælde af at en bakterie er blevet dyrket) eller et negativt resultat (i tilfælde af at der ikke blev påvist bakterier). I tilfælde af at testene er positive, viser begge teknikker også, hvilke bakterier der blev fundet, som kunne bruges til at ændre antibiotikakur for at målrette den specifikke dyrkede bakterie. Processen med MC kan dog afsluttes inden for 4 timer, hvilket er meget kortere end inkubationsperioden for guldstandardblodkulturen, som er 36-72 timer. Når der ikke er sepsis (og dermed ingen bakterier i blodbanen), vil MC vise sig negativt også inden for 4 timer og kan dermed guide klinikere til at stoppe antibiotika hos uinficerede børn meget hurtigere sammenlignet med den konventionelle blodkultur.

Blodkulturer er stadig guldstandard, men antages generelt at have lav følsomhed for diagnosticering af sepsis hos nyfødte og børn og er tidskrævende. Tilfælde af sepsis kan blive overset af kulturer, og en mere følsom diagnostisk test såsom molekylære tests som MC kan være nyttig. Fremskridt inden for mikrobiel teknologi har ført til udviklingen af ​​hurtige molekylære metoder såsom MC, der kan være mere følsomme end kultur. Flere nye molekylære teknikker, såsom kvantitativ PCR, bredspektret konventionel PCR og multiplex PCR, er blevet undersøgt for at påvise neonatal sepsis. Disse teknikker er dog rettet mod specifikke arter, hvilket gør det umuligt at påvise alle bakteriearter. Alt, der ikke er eksplicit søgt efter, vil således blive savnet. I modsætning hertil har MC evnen til at opdage enhver bakterieart, der kan forårsage bakteriel neonatal sepsis.

MC-teknikken er valideret til at påvise disse patogene bakterier i kropsvæsker. En række artikler, der validerer alle aspekter af MC-teknikken, er blevet offentliggjort sidste år. Desuden bruges MC på hospitaler på intensivafdelingen til at påvise bakterier i ellers sterile prøver som blod, men også på prøver fra bylder. En principiel undersøgelse på 39 nyfødte, mistænkelige for EOS, hvoraf der blev taget yderligere blodprøver fra både navlestrenge såvel som fra perifer flebotomi, viste, at MC var i stand til at påvise en patogen bakteriestamme, der højst sandsynligt var den forårsagende organisme for sepsis hos et spædbarn, der var klinisk sygt. Konventionel dyrkning gav ingen resultater for denne patient. 2 yderligere MC-prøver viste stammer, der sandsynligvis var kontaminanter hos spædbørn, som var klinisk velfungerende, hvis konventionel kultur forblev negative. Der blev ikke set andre uoverensstemmelser. Denne undersøgelse viste også, at MC på blodprøver, der var tilsat udbredte bakteriestammer for neonatal sepsis, viste en meget høj overensstemmelse med kvantitativ PCR som kontroldiagnostik. Større undersøgelser er nødvendige for at bekræfte diagnostisk nøjagtighed på grund af den meget lave forekomst af kulturpåvist sepsis .

Resultater fra en anden undersøgelse, der bruger MC-teknikken til at påvise bakterier i menneskelig kropsvæske, er lovende. I denne undersøgelse blev 66 prøver indsamlet og testet ved konventionel kultur og MC. I 100 % af prøverne med en positiv kultur var MC også positiv. I fem prøver viste den konventionelle kultur sig at være negativ, mens MC var positiv. Casehistorierne for disse fem patienter blev indhentet og antydede, at MC-fundene var yderst klinisk relevante og derfor kan have højere følsomhed sammenlignet med konventionel blodkultur.

Sammenfattende gør den hurtige påvisning MC potentielt bedre rustet til at vejlede klinisk beslutningstagning for behandling af sepsis hos nyfødte og børn. Imidlertid er egnetheden af ​​MC i denne specifikke population ikke blevet undersøgt tilstrækkeligt. Derfor bør der udføres en undersøgelse af høj kvalitet for at bestemme den diagnostiske nøjagtighed af MC for sepsis hos nyfødte og børn, og om denne teknik kan erstatte den konventionelle blodkultur.