Coltura molecolare per la diagnosi di sepsi pediatrica (CHAMPIONS)

I neonati e i bambini spesso ricevono antibiotici per il sospetto di sepsi. La sepsi presenta un’elevata morbilità e mortalità nei neonati e nei bambini. Nei Paesi Bassi fino al 50% dei bambini viene prescritto almeno un ciclo di antibiotici nei primi 4 anni di vita. Nel periodo postnatale, gli antibiotici vengono spesso prescritti per presunte infezioni batteriche nei reparti neonatali e pediatrici, ma in circa il 30% di questi pazienti l'infezione batterica non è dimostrata.

La diagnosi rapida della sepsi nei neonati e nei bambini è problematica perché i segni clinici iniziano in modo subdolo e non sono specifici. Il gold standard per la diagnosi della sepsi batterica è l’emocoltura convenzionale. Sfortunatamente, la coltura batterica richiede molto tempo (tempo per ottenere il risultato fino a 36-72 ore) e manca di sensibilità in questa popolazione per la sepsi. Per questo motivo, i bambini e i neonati con fattori di rischio per l'infezione o segni e sintomi clinici di infezione vengono trattati empiricamente con antibiotici al sospetto iniziale di sepsi, in attesa dei risultati dell'emocoltura convenzionale. Attualmente nei Paesi Bassi più dell’85% dei neonati molto prematuri (età gestazionale <30 settimane) ricevono antibiotici per il rischio di sepsi ad esordio precoce (EOS) e circa due terzi vengono valutati almeno una volta per la sepsi a esordio tardivo (LOS). ). Anche ai bambini più grandi vengono spesso prescritti antibiotici empiricamente per presunta sepsi, in attesa dei risultati dell'emocoltura.

Esistono prove sempre più evidenti che, oltre alla resistenza agli antibiotici, l’uso di antibiotici nel periodo neonatale e durante l’infanzia altera il microbioma con un aumento del rischio di effetti avversi immediati e a lungo termine, come un aumento del rischio di asma, obesità, allergie e malattie infiammatorie. malattie intestinali (IBD). Per evitare trattamenti non necessari nei bambini non infetti, un test di laboratorio precoce, rapido, sensibile e specifico sarebbe utile per guidare i medici a decidere quando interrompere gli antibiotici il prima possibile.

Un'altra tecnica per rilevare la sepsi neonatale rapidamente e in una fase precedente rispetto all'emocoltura convenzionale è la Coltura Molecolare (MC). MC è una tecnica di coltura rapida a base molecolare in grado di identificare i batteri entro 4 ore dal prelievo di sangue. In breve, MC è una tecnica di profilazione basata sul DNA, che differenzia tra specie batteriche in base a differenze specie-specifiche nella lunghezza nucleotidica della regione dell'interspacer (IS) rDNA 16S-23S utilizzando primer di reazione a catena della polimerasi (PCR) marcati in modo fluorescente specifici del phylum. Una procedura MC standard consiste di due PCR separate. Nella prima PCR vengono aggiunti due diversi primer, un primer marca in modo fluorescente i membri dei phyla Firmicutes, Actinobacter, Fusobacteria e Verrucomicrobia (FAFV), mentre il secondo primer marca i membri del phylum Bacteroidetes. Nella seconda PCR, viene aggiunto un terzo primer marcato mirato ai membri del phylum Proteobacteria. Successivamente, questi prodotti della PCR possono essere amplificati e i frammenti di DNA possono essere separati in base alla loro lunghezza nucleotidica. Alla fine, verrà creato un tipico profilo microbico MC, costituito da una serie di picchi etichettati a colori. Ciascun picco rappresenta una singola unità tassonomica operativa batterica (OTU) a seconda della lunghezza del nucleotide del frammento IS, la lunghezza di questi picchi dimostra la concentrazione di questa particolare OTU, mentre i colori dei picchi forniscono informazioni sui phyla presenti (FAFV, Bacteroidetes o Proteobacteria) .

Nella sepsi batterica, un batterio ha raggiunto il flusso sanguigno altrimenti sterile causando la sepsi a causa della disregolazione della risposta immunitaria dell'ospite e/o di una reazione delle endotossine batteriche. Sia l'emocoltura che la MC possono rilevare i batteri e dare un risultato positivo (nel caso in cui un batterio sia stato coltivato) o un risultato negativo (nel caso in cui non sia stato rilevato alcun batterio). Nel caso in cui i test siano positivi, entrambe le tecniche mostrano anche quale batterio è stato trovato, cosa che potrebbe essere utilizzata per modificare il regime antibiotico per colpire quello specifico batterio in coltura. Tuttavia, il processo di MC può essere completato entro 4 ore, che è molto più breve del periodo di incubazione dell'emocoltura gold standard che è di 36-72 ore. Quando non c'è sepsi (e quindi nessun batterio nel flusso sanguigno), l'MC risulterà negativo anche entro 4 ore e quindi potrebbe guidare i medici a sospendere la somministrazione di antibiotici nei bambini non infetti molto più rapidamente rispetto all'emocoltura convenzionale.

Le emocolture rappresentano ancora il gold standard, ma generalmente si presume che abbiano una bassa sensibilità per la diagnosi di sepsi nei neonati e nei bambini e richiedono molto tempo. I casi di sepsi possono non essere rilevati dalle colture e può essere utile un test diagnostico più sensibile come i test molecolari come l'MC. I progressi nella tecnologia microbica hanno portato allo sviluppo di metodi molecolari rapidi come la MC, che potrebbero essere più sensibili della coltura. Per rilevare la sepsi neonatale sono state studiate molteplici nuove tecniche molecolari, come la PCR quantitativa, la PCR convenzionale ad ampio spettro e la PCR multiplex. Tuttavia, queste tecniche sono dirette a specie specifiche, il che rende impossibile rilevare tutte le specie batteriche. Pertanto, tutto ciò che non viene cercato esplicitamente verrà perso. Al contrario, MC ha la capacità di rilevare ogni specie batterica che può causare sepsi neonatale batterica.

La tecnica MC è validata per rilevare questi batteri patogeni nei fluidi corporei. Negli ultimi anni sono stati pubblicati una serie di articoli che convalidano tutti gli aspetti della tecnica MC. Inoltre, la MC viene utilizzata negli ospedali dei reparti di terapia intensiva per rilevare batteri in campioni altrimenti sterili come il sangue, ma anche su campioni ottenuti da ascessi. Uno studio di prova di principio su 39 neonati sospetti per EOS, dei quali sono stati prelevati ulteriori campioni di sangue da entrambi i cordoni ombelicali e da prelievi periferici, ha dimostrato che MC era in grado di rilevare un ceppo batterico patogeno che era molto probabilmente l'organismo causativo dell'EOS. sepsi in un bambino clinicamente malato. La coltura convenzionale non ha prodotto alcun risultato per questo paziente. Altri 2 campioni MC hanno mostrato ceppi che probabilmente erano contaminanti in neonati clinicamente sani, dove la coltura convenzionale era rimasta negativa. Non sono state riscontrate altre discrepanze. Questo studio ha anche dimostrato che la MC su campioni di sangue arricchiti con ceppi batterici prevalenti per la sepsi neonatale, ha mostrato un accordo molto elevato con la PCR quantitativa come diagnostico di controllo. Sono necessari studi più ampi per corroborare l'accuratezza diagnostica data la bassissima incidenza di sepsi comprovata dalla coltura .

I risultati di un altro studio che utilizza la tecnica MC per rilevare i batteri nei fluidi corporei umani sono promettenti. In questo studio sono stati raccolti e analizzati 66 campioni mediante coltura convenzionale e MC. Nel 100% dei campioni con coltura positiva, anche il MC era positivo. In cinque campioni la coltura convenzionale è risultata negativa, mentre la MC è risultata positiva. Le storie dei casi di questi cinque pazienti sono state ottenute e hanno suggerito che i risultati del MC erano altamente rilevanti dal punto di vista clinico e quindi potrebbero avere una sensibilità più elevata rispetto all'emocoltura convenzionale.

In sintesi, il rilevamento rapido rende l’MC potenzialmente più attrezzato per guidare il processo decisionale clinico per la gestione della sepsi nei neonati e nei bambini. Tuttavia, l’idoneità della MC in questa popolazione specifica non è stata studiata adeguatamente. Pertanto, dovrebbe essere eseguito uno studio di alta qualità per determinare l'accuratezza diagnostica della MC per la sepsi nei neonati e nei bambini e se questa tecnica può sostituire l'emocoltura convenzionale.