Molekyylikulttuuri lasten sepsiksen diagnosointiin (CHAMPIONS)

Vastasyntyneet ja lapset saavat usein antibiootteja epäiltäessä sepsistä. Sepsis on korkea sairastuvuus ja kuolleisuus vastasyntyneillä ja lapsilla. Jopa 50 %:lle Alankomaiden lapsista määrätään vähintään yksi antibioottikuuri neljän ensimmäisen elinvuoden aikana. Synnytyksen jälkeen antibiootteja määrätään usein oletettuihin bakteeri-infektioihin vastasyntyneiden ja lasten osastoilla, mutta noin 30 %:lla näistä potilaista bakteeri-infektiota ei ole todistettu.

Sepsiksen nopea diagnosointi vastasyntyneillä ja lapsilla on ongelmallista, koska kliiniset oireet alkavat hienovaraisesti ja ovat epäspesifisiä. Kultastandardi bakteerisepsiksen diagnosoinnissa on tavanomainen veriviljely. Valitettavasti bakteeriviljely on aikaa vievää (tulokseen kuluu aikaa jopa 36–72 tuntia) eikä se ole herkkä tässä populaatiossa sepsikselle. Tästä syystä lapsia ja vauvoja, joilla on infektion riskitekijöitä tai infektion kliinisiä merkkejä ja oireita, hoidetaan empiirisesti antibiooteilla alkuperäisessä sepsisepäilyssä odotettaessa tavanomaisen veriviljelyn tuloksia. Tällä hetkellä yli 85 % hyvin keskosista (raskausikä alle 30 viikkoa) saa antibiootteja varhaisvaiheen sepsiksen (EOS) riskin vuoksi Alankomaissa ja noin kaksi kolmasosaa arvioidaan vähintään kerran myöhään alkavan sepsiksen (LOS) varalta. ) . Myös vanhemmille lapsille määrätään usein empiirisesti antibiootteja oletettuun sepsikseen odottaen veriviljelyn tuloksia.

On yhä enemmän näyttöä siitä, että antibioottiresistenssin lisäksi antibioottien käyttö vastasyntyneellä ja lapsuudessa muuttaa mikrobiomia ja lisää välittömien ja pitkäaikaisten haittavaikutusten riskiä, ​​kuten astman, liikalihavuuden, allergioiden ja tulehdusten lisääntymisen riskiä. suolistosairaudet (IBD). Tartunnan saamattomien lasten tarpeettoman hoidon välttämiseksi varhainen, nopea, herkkä ja spesifinen laboratoriotesti auttaisi ohjaajia päättämään, milloin antibioottien käyttö lopetetaan mahdollisimman pian.

Toinen tekniikka vastasyntyneiden sepsiksen havaitsemiseksi nopeasti ja aikaisemmassa vaiheessa tavanomaiseen veriviljelyyn verrattuna on molekyylikulttuuri (MC). MC on nopea molekyylipohjainen viljelytekniikka, joka pystyy tunnistamaan bakteerit 4 tunnin sisällä verinäytteen ottamisesta. Lyhyesti sanottuna MC on DNA-pohjainen profilointitekniikka, joka erottaa bakteerilajit lajispesifisten erojen perusteella 16S-23S rDNA interspacer (IS) -alueen nukleotidipituuksissa käyttämällä pesäkohtaisia ​​fluoresoivasti leimattuja polymeraasiketjureaktioalukkeita (PCR). Tavallinen MC-menettely koostuu kahdesta erillisestä PCR:stä. Ensimmäisessä PCR:ssä lisätään kaksi erilaista aluketta, joista yksi aluke leimaa fluoresoivasti Firmicutes-, Actinobacter-, Fusobacteria- ja Verrucomicrobia- (FAFV) -heimon jäseniä, kun taas toinen aluke leimaa Bacteroidetes-heimon jäseniä. Toisessa PCR:ssä lisätään kolmas leimattu aluke, joka kohdistuu Proteobacteria-suvun jäseniin. Myöhemmin nämä PCR-tuotteet voidaan monistaa ja DNA-fragmentit voidaan erottaa niiden nukleotidipituuden perusteella. Lopulta luodaan tyypillinen MC-mikrobiprofiili, joka koostuu joukosta värileimattuja huippuja. Jokainen huippu edustaa yksittäistä bakteerin toiminnallista taksonomista yksikköä (OTU) riippuen IS-fragmentin nukleotidipituudesta, näiden piikkien pituudesta, joka osoittaa tämän tietyn OTU:n pitoisuuden, kun taas huippujen värit tarjoavat tietoa nykyisestä fylasta (FAFV, Bacteroidetes tai Proteobacteria) .

Bakteerisepsiksessä bakteeri on päässyt muutoin steriiliin verenkiertoon aiheuttaen sepsiksen isännän immuunivasteen säätelyhäiriön ja/tai bakteerien endotoksiinien reaktion seurauksena. Sekä veriviljely että MC voivat havaita bakteerit ja antaa positiivisen tuloksen (jos bakteeria on viljelty) tai negatiivisen tuloksen (jos bakteeria ei havaittu). Jos testit ovat positiivisia, molemmat tekniikat osoittavat myös, mitkä bakteerit löydettiin, ja niitä voitaisiin käyttää muuttamaan antibioottihoitoa kyseisen viljellyn bakteerin kohdistamiseksi. MC-prosessi voidaan kuitenkin saada päätökseen 4 tunnissa, mikä on paljon lyhyempi kuin kultastandardin veriviljelmän inkubaatioaika, joka on 36-72 tuntia. Kun sepsistä ei ole (eikä bakteereja verenkierrossa), MC osoittautuu negatiiviseksi myös 4 tunnin sisällä ja voi siten ohjata lääkärit lopettamaan antibioottien käytön tartuttamattomilla lapsilla paljon nopeammin kuin perinteisessä veriviljelyssä.

Veriviljelyt ovat edelleen kultastandardi, mutta niiden oletetaan yleensä olevan alhainen herkkyys diagnosoida vastasyntyneiden ja lasten sepsis ja ne vievät aikaa. Viljelmät voivat jäädä huomiotta sepsistapauksista, ja herkempi diagnostinen testi, kuten molekyylitestit, kuten MC, voi olla hyödyllinen. Mikrobiteknologian kehitys on johtanut nopeiden molekyylimenetelmien, kuten MC:n, kehittämiseen, jotka voivat olla herkempiä kuin viljely. Vastasyntyneiden sepsiksen havaitsemiseksi on tutkittu useita uusia molekyylitekniikoita, kuten kvantitatiivinen PCR, laaja-alainen perinteinen PCR ja multipleksinen PCR. Nämä tekniikat on kuitenkin suunnattu tiettyihin lajeihin, mikä tekee mahdottomaksi havaita kaikkia bakteerilajeja. Siten kaikki, mitä ei ole nimenomaisesti etsitty, jää paitsi. Sitä vastoin MC:llä on kyky havaita kaikki bakteerilajit, jotka voivat aiheuttaa vastasyntyneiden bakteerisepsiksen.

MC-tekniikka on validoitu havaitsemaan nämä patogeeniset bakteerit kehon nesteistä. Sarja julkaisuja, jotka validoivat MC-tekniikan kaikkia näkökohtia, on julkaistu viime vuosina. Lisäksi MC:tä käytetään sairaaloissa tehohoidossa bakteerien havaitsemiseen muuten steriileistä näytteistä, kuten verestä, mutta myös paiseista otetuista näytteistä. Todistetutkimus 39 vastasyntyneellä, joilla oli epäilyjä EOS:stä, joilta otettiin lisää verinäytteitä molemmista napanuorasta sekä perifeerisestä flebotomiasta, osoitti, että MC pystyi havaitsemaan patogeenisen bakteerikannan, joka oli erittäin todennäköinen taudin aiheuttaja. sepsis yhdellä kliinisesti sairaalla lapsella. Perinteinen viljely ei tuottanut mitään tuloksia tälle potilaalle. Kaksi muuta MC-näytettä osoittivat kantoja, jotka olivat todennäköisesti kontaminantteja pikkulapsissa ja jotka ilmenivät kliinisesti hyvin, jos tavanomainen viljely pysyi negatiivisena. Muita poikkeamia ei havaittu. Tämä tutkimus osoitti myös, että MC verinäytteissä, joihin oli lisätty vallitsevia bakteerikantoja vastasyntyneen sepsiksen vuoksi, osoitti erittäin suurta yhtäpitävyyttä kvantitatiivisen PCR:n kanssa kontrollidiagnostisena. Diagnostisen tarkkuuden vahvistamiseksi tarvitaan laajempia tutkimuksia, koska viljelyssä todettu sepsis on erittäin alhainen. .

Tulokset toisesta tutkimuksesta, jossa käytettiin MC-tekniikkaa bakteerien havaitsemiseksi ihmiskehon nesteestä, ovat lupaavia. Tässä tutkimuksessa kerättiin 66 näytettä ja testattiin tavanomaisella viljelmällä ja MC:llä. 100 %:ssa näytteistä, joissa oli positiivinen viljelmä, MC oli myös positiivinen. Viidessä näytteessä tavanomainen viljelmä osoittautui negatiiviseksi, kun taas MC oli positiivinen. Näiden viiden potilaan tapaushistoriat saatiin, ja niissä ehdotettiin, että MC-löydökset olivat kliinisesti erittäin merkittäviä, ja siten niillä voi olla suurempi herkkyys verrattuna tavanomaiseen veriviljelyyn.

Yhteenvetona voidaan todeta, että nopea havaitseminen tekee MC:stä mahdollisesti paremmat mahdollisuudet ohjata kliinistä päätöksentekoa vastasyntyneiden ja lasten sepsiksen hoidossa. MC:n soveltuvuutta tähän populaatioon ei ole kuitenkaan tutkittu riittävästi. Siksi on suoritettava korkealaatuinen tutkimus vastasyntyneiden ja lasten sepsiksen diagnostisen tarkkuuden määrittämiseksi ja voiko tämä tekniikka korvata tavanomaisen veriviljelyn.