Molekuláris kultúra a gyermekkori szepszis diagnosztizálására (CHAMPIONS)

Az újszülöttek és a gyermekek gyakran kapnak antibiotikumot szepszis gyanúja miatt. A szepszis magas morbiditást és mortalitást mutat újszülötteknél és gyermekeknél. Hollandiában a gyermekek 50%-ának legalább egy antibiotikum-kúrát írnak fel az első 4 életévben. Posztnatálisan gyakran írnak fel antibiotikumot feltételezett bakteriális fertőzésekre az újszülött- és gyermekosztályokon, de ezeknek a betegeknek körülbelül 30%-ánál nem bizonyított a bakteriális fertőzés.

A szepszis gyors diagnosztizálása újszülötteknél és gyermekeknél problematikus, mivel a klinikai tünetek finomak és nem specifikusak. A bakteriális szepszis diagnosztizálásának arany standardja a hagyományos vérkultúra. Sajnos a bakteriális tenyésztés időigényes (az eredmény eléréséhez szükséges idő akár 36-72 óra), és ebben a populációban nincs érzékeny a szepszisre. Emiatt a fertőzés kockázati tényezőivel vagy a fertőzés klinikai tüneteivel rendelkező gyermekeket és csecsemőket kezdeti szepszis gyanú esetén empirikusan kezelik antibiotikumokkal, megvárva a hagyományos vértenyésztés eredményeit. Jelenleg a nagyon koraszülött csecsemők (30 hét alatti terhességi kor) több mint 85%-a kap antibiotikumot a korai szepszis (EOS) kockázata miatt Hollandiában, és körülbelül kétharmadukat legalább egyszer értékelik késői szepszis (LOS) miatt. ) . Az idősebb gyermekeknek is gyakran empirikusan írnak fel antibiotikumot feltételezett szepszisre, várva a vértenyésztés eredményét.

Egyre több bizonyíték áll rendelkezésre arra vonatkozóan, hogy az antibiotikum-rezisztencia mellett az antibiotikumok újszülöttkori és gyermekkori alkalmazása megváltoztatja a mikrobiomot, ami növeli az azonnali és hosszú távú káros hatások kockázatát, mint például az asztma, az elhízás, az allergiák és a gyulladások fokozott kockázata. bélbetegségek (IBD). A nem fertőzött gyermekek szükségtelen kezelésének elkerülése érdekében egy korai, gyors, érzékeny és specifikus laboratóriumi vizsgálat segítene abban, hogy a klinikusok eldönthessék, mikor kell a lehető leghamarabb abbahagyni az antibiotikum-kezelést.

Egy másik módszer az újszülöttkori szepszis gyors és korábbi stádiumban történő kimutatására a hagyományos vérkultúrához képest a molekuláris kultúra (MC). Az MC egy gyors molekuláris alapú tenyésztési technika, amely a vérmintavételt követő 4 órán belül képes azonosítani a baktériumokat. Röviden, az MC egy DNS-alapú profilalkotási technika, amely a 16S-23S rDNS interspacer (IS) régió nukleotidhosszának fajspecifikus különbségei alapján tesz különbséget a baktériumfajok között, törzsspecifikus fluoreszcensen jelölt polimeráz láncreakciós (PCR) primerek használatával. Egy szabványos MC eljárás két különálló PCR-ből áll. Az első PCR-ben két különböző primert adnak hozzá, az egyik primer fluoreszcensen jelöli a phyla Firmicutes, Actinobacter, Fusobacteria és Verrucomicrobia (FAFV) tagjait, míg a második primer a Bacteroidetes törzs tagjait jelöli. A második PCR-ben egy harmadik jelölt primert adnak hozzá, amely a Proteobacteria törzs tagjait célozza meg. Ezt követően ezek a PCR-termékek amplifikálhatók, és a DNS-fragmensek nukleotidhosszuk alapján elválaszthatók. Végül egy tipikus MC mikrobiális profil jön létre, amely színnel jelölt csúcsokból áll. Minden egyes csúcs egy egyedi bakteriális működési taxonómiai egységet (OTU) képvisel az IS fragmentum nukleotidhosszától függően, ezen csúcsok hossza az adott OTU koncentrációját mutatja, míg a csúcsok színei a jelenlévő törzsről (FAFV, Bacteroidetes vagy Proteobacteria) nyújtanak információt. .

Bakteriális szepszisben a baktérium a gazdaszervezet immunválaszának szabályozási zavara és/vagy bakteriális endotoxinok reakciója következtében szepszist okozva jutott el az egyébként steril véráramba. Mind a vérkultúra, mind az MC képes kimutatni a baktériumokat, és pozitív eredményt ad (ha baktériumot tenyésztettek) vagy negatív eredményt (ha nem észleltek baktériumot). Abban az esetben, ha a tesztek pozitívak, mindkét technika azt is megmutatja, hogy mely baktériumokat találták, amelyekkel módosítani lehetne az antibiotikum-kezelést az adott tenyésztett baktérium megcélzására. Az MC folyamata azonban 4 órán belül befejezhető, ami jóval rövidebb, mint a gold standard vértenyészet inkubációs ideje, amely 36-72 óra. Ha nincs szepszis (és így nincs baktérium a véráramban), akkor az MC 4 órán belül is negatív lesz, és így a hagyományos vérkultúrához képest sokkal gyorsabban leállíthatja a klinikusokat az antibiotikumok szedésében nem fertőzött gyermekeknél.

A vérkultúrák még mindig aranystandardnak számítanak, de általában feltételezik, hogy alacsony érzékenységgel rendelkeznek az újszülöttek és gyermekek szepszisének diagnosztizálására, és időigényesek. A szepszis eseteit kihagyhatják a tenyészetek, és hasznos lehet egy érzékenyebb diagnosztikai teszt, például molekuláris tesztek, mint például az MC. A mikrobiális technológia fejlődése olyan gyors molekuláris módszerek kifejlesztéséhez vezetett, mint például az MC, amelyek érzékenyebbek lehetnek, mint a tenyésztés. Számos új molekuláris technikát, például kvantitatív PCR-t, széles körű hagyományos PCR-t és multiplex PCR-t tanulmányoztak az újszülöttkori szepszis kimutatására. Ezek a technikák azonban meghatározott fajokra irányulnak, ami lehetetlenné teszi az összes baktériumfaj kimutatását. Így minden, amit nem keresnek kifejezetten, hiányozni fog. Ezzel szemben az MC képes kimutatni minden olyan baktériumfajt, amely bakteriális újszülöttkori szepszist okozhat.

Az MC-technika validált ezen patogén baktériumok kimutatására a testnedvekben. Az elmúlt években egy sor tanulmány jelent meg, amelyek az MC technika minden aspektusát érvényesítik. Ezenkívül az MC-t kórházakban használják az intenzív osztályon a baktériumok kimutatására az egyébként steril mintákban, például vérben, de a tályogokból vett mintákon is. Egy 39 EOS-gyanús újszülötten végzett elvi vizsgálat, akiknél további vérmintát vettek mindkét köldökzsinórból, valamint perifériás phlebotomiából, azt mutatta, hogy az MC képes volt kimutatni egy patogén baktériumtörzset, amely nagy valószínűséggel a kórokozója volt. szepszis egy klinikailag beteg csecsemőnél. A hagyományos tenyésztés nem adott eredményt ennél a betegnél. 2 további MC minta olyan törzseket mutatott ki, amelyek valószínűleg szennyezőnek bizonyultak a csecsemőkben, amelyek klinikailag jól látszottak, ha a hagyományos tenyésztés negatív maradt. Egyéb eltérést nem tapasztaltak. Ez a tanulmány azt is kimutatta, hogy az újszülöttkori szepszis miatt elterjedt baktériumtörzsekkel megtapasztalt vérminták MC-je nagyon nagy egyezést mutatott a kvantitatív PCR-rel, mint kontrolldiagnosztikai módszerrel. Nagyobb vizsgálatokra van szükség a diagnosztikai pontosság igazolására, tekintettel a tenyésztéssel bizonyított szepszis nagyon alacsony előfordulására. .

Ígéretesek az emberi testfolyadékban lévő baktériumok kimutatására szolgáló MC technikával végzett másik tanulmány eredményei. Ebben a vizsgálatban 66 mintát gyűjtöttünk és teszteltünk hagyományos tenyésztéssel és MC-vel. A pozitív tenyészetet tartalmazó minták 100%-ában az MC is pozitív volt. Öt mintában a hagyományos tenyészet negatívnak bizonyult, míg az MC pozitív volt. Ennek az öt betegnek a kórtörténetét összegyűjtöttük, és azt sugallták, hogy az MC-leletek klinikailag rendkívül relevánsak voltak, és így nagyobb érzékenységgel rendelkezhetnek a hagyományos vértenyészethez képest.

Összefoglalva, a gyors felismerés révén az MC potenciálisan jobban fel van szerelve arra, hogy irányítsa a klinikai döntéshozatalt az újszülöttek és gyermekek szepszisének kezelésére. Az MC alkalmasságát azonban ebben a specifikus populációban nem vizsgálták megfelelően. Ezért jó minőségű vizsgálatot kell végezni annak megállapítására, hogy az MC diagnosztikai pontos-e szepszis újszülötteknél és gyermekeknél, és hogy ez a technika helyettesítheti-e a hagyományos vérkultúrát.