Molekulární kultivace pro diagnostiku dětské sepse (CHAMPIONS)

Novorozenci a děti často dostávají antibiotika pro podezření na sepsi. Sepse má vysokou morbiditu a mortalitu u novorozenců a dětí. Až 50 % dětí v Nizozemsku má předepsán alespoň jeden cyklus antibiotik během prvních 4 let života. Postnatálně jsou antibiotika často předepisována pro předpokládané bakteriální infekce na novorozeneckých a dětských odděleních, ale u přibližně 30 % těchto pacientů není bakteriální infekce prokázána.

Rychlá diagnostika sepse u novorozenců a dětí je problematická, protože klinické příznaky začínají nenápadně a jsou nespecifické. Zlatým standardem pro diagnostiku bakteriální sepse je konvenční hemokultura. Bakteriální kultivace je bohužel časově náročná (doba do dosažení výsledku až 36-72 hodin) a postrádá citlivost v této populaci na sepsi. Z tohoto důvodu jsou děti a kojenci s rizikovými faktory pro infekci nebo s klinickými příznaky a symptomy infekce léčeni antibiotiky empiricky při počátečním podezření na sepsi a čekají na výsledky konvenční hemokultury. V současné době více než 85 % velmi předčasně narozených dětí (gestační věk < 30 týdnů) dostává antibiotika pro riziko časné sepse (EOS) v Nizozemsku a přibližně dvě třetiny jsou alespoň jednou vyšetřeny na sepsi s pozdním nástupem (LOS ). Také starším dětem jsou často empiricky předepisována antibiotika pro předpokládanou sepsi a čekají na výsledky hemokultury.

Přibývá důkazů, že kromě rezistence na antibiotika mění používání antibiotik v novorozeneckém období a během dětství mikrobiom se zvýšeným rizikem okamžitých a dlouhodobých nežádoucích účinků, jako je zvýšené riziko astmatu, obezity, alergií a zánětlivých onemocnění. onemocnění střev (IBD). Aby se předešlo zbytečné léčbě neinfikovaných dětí, pomohl by časný, rychlý, citlivý a specifický laboratorní test lékařům pomoci při rozhodování, kdy antibiotika co nejdříve vysadit.

Další technikou pro rychlou detekci neonatální sepse a v časnějším stadiu ve srovnání s konvenční hemokulturou je Molecular Culture (MC). MC je rychlá molekulární kultivační technika, která je schopna identifikovat bakterie do 4 hodin po odběru krve. Stručně řečeno, MC je technika profilování založená na DNA, která rozlišuje mezi bakteriálními druhy na základě druhově specifických rozdílů v délce nukleotidů 16S-23S rDNA interspacer (IS) oblasti pomocí kmenově specifických fluorescenčně značených primerů polymerázové řetězové reakce (PCR). Standardní MC postup sestává ze dvou samostatných PCR. V první PCR jsou přidány dva různé primery, jeden primer fluorescenčně značící členy kmene Firmicutes, Actinobacter, Fusobacteria a Verrucomicrobia (FAFV), zatímco druhý primer označuje členy kmene Bacteroidetes. Ve druhé PCR je přidán třetí značený primer zacílený na členy kmene Proteobacteria. Následně mohou být tyto produkty PCR amplifikovány a fragmenty DNA mohou být separovány na základě jejich délky nukleotidů. Nakonec bude vytvořen typický mikrobiální profil MC, sestávající ze sady barevně značených píků. Každý pík představující individuální bakteriální operační taxonomickou jednotku (OTU) v závislosti na délce nukleotidu fragmentu IS, délka těchto píku demonstruje koncentraci tohoto konkrétního OTU, zatímco barvy píku poskytují informace o přítomném kmeni (FAFV, Bacteroidetes nebo Proteobacteria) .

Při bakteriální sepsi se bakterie dostala do jinak sterilního krevního řečiště a způsobila sepsi v důsledku dysregulace imunitní odpovědi hostitele a/nebo reakce bakteriálních endotoxinů. Jak hemokultura, tak MC mohou detekovat bakterie a poskytnout pozitivní výsledek (v případě, že byla bakterie kultivována) nebo negativní výsledek (v případě, že nebyly zjištěny žádné bakterie). V případě, že jsou testy pozitivní, obě techniky také ukazují, které bakterie byly nalezeny, což by mohlo být použito ke změně antibiotického režimu tak, aby cílil na konkrétní kultivovanou bakterii. Proces MC však může být ukončen do 4 hodin, což je mnohem kratší doba než inkubační doba zlatého standardu hemokultury, která je 36-72 hodin. Pokud nedojde k sepsi (a tedy žádné bakterie v krevním řečišti), MC vyjde negativně také do 4 hodin a může tak navést lékaře k vysazení antibiotik u neinfikovaných dětí mnohem rychleji ve srovnání s konvenční hemokulturou.

Hemokultury jsou stále zlatým standardem, ale obecně se předpokládá, že mají nízkou senzitivitu pro diagnostiku sepse u novorozenců a dětí a jsou časově náročné. Případy sepse mohou kultivace přehlédnout a může být užitečný citlivější diagnostický test, jako jsou molekulární testy jako MC. Pokroky v mikrobiální technologii vedly k vývoji rychlých molekulárních metod, jako je MC, které mohou být citlivější než kultivace. Pro detekci neonatální sepse bylo studováno mnoho nových molekulárních technik, jako je kvantitativní PCR, širokopásmová konvenční PCR a multiplexní PCR. Tyto techniky jsou však zaměřeny na specifické druhy, což znemožňuje detekci všech bakteriálních druhů. Tedy vše, co není vysloveně hledáno, bude chybět. Naproti tomu MC má schopnost detekovat každý bakteriální druh, který může způsobit bakteriální neonatální sepsi.

Technika MC je ověřena pro detekci těchto patogenních bakterií v tělesných tekutinách. V minulých letech byla publikována řada článků ověřujících všechny aspekty techniky MC. Kromě toho se MC používá v nemocnicích na jednotce intenzivní péče k detekci bakterií v jinak sterilních vzorcích, jako je krev, ale také ve vzorcích získaných z abscesů. Důkaz principiální studie na 39 novorozencích podezřelých z EOS, kterým byly odebrány další vzorky krve z obou pupečníkových šňůr a také z periferní flebotomie, ukázal, že MC byla schopna detekovat patogenní bakteriální kmen, který byl velmi pravděpodobně původcem sepse u jednoho kojence, který byl klinicky nemocný. Konvenční kultivace nepřinesla u tohoto pacienta žádné výsledky. 2 další vzorky MC ukázaly kmeny, které byly pravděpodobně kontaminujícími u kojenců, které byly klinicky dobře vypadající, pokud konvenční kultivace zůstala negativní. Nebyly zjištěny žádné další nesrovnalosti. Tato studie také ukázala, že MC ve vzorcích krve, které byly obohaceny prevalentními bakteriálními kmeny pro neonatální sepsi, vykazovala velmi vysokou shodu s kvantitativní PCR jako kontrolní diagnostikou. K potvrzení diagnostické přesnosti jsou zapotřebí rozsáhlejší studie vzhledem k velmi nízkému výskytu kultivačně prokázané sepse .

Slibné jsou výsledky jiné studie využívající techniku ​​MC k detekci bakterií v lidské tělesné tekutině. V této studii bylo odebráno a testováno 66 vzorků konvenční kulturou a MC. U 100 % vzorků s pozitivní kulturou byla pozitivní i MC. V pěti vzorcích se konvenční kultura ukázala jako negativní, zatímco MC byla pozitivní. Byly získány anamnézy těchto pěti pacientů a naznačovaly, že nálezy MC byly vysoce klinicky relevantní, a proto mohou mít vyšší senzitivitu ve srovnání s konvenční hemokulturou.

Stručně řečeno, rychlá detekce činí MC potenciálně lépe vybavena pro vedení klinického rozhodování o léčbě sepse u novorozenců a dětí. Vhodnost MC v této specifické populaci však nebyla dostatečně prozkoumána. Proto by měla být provedena vysoce kvalitní studie ke stanovení diagnostické přesnosti MC pro sepsi u novorozenců a dětí a zda tato technika může nahradit konvenční hemokulturu.