Молекулярная культура для диагностики детского сепсиса (CHAMPIONS)

Новорожденным и детям часто назначают антибиотики при подозрении на сепсис. Сепсис имеет высокую заболеваемость и смертность среди новорожденных и детей. До 50% детей в Нидерландах назначают хотя бы один курс антибиотиков в первые 4 года жизни. В постнатальном периоде антибиотики часто назначают при предполагаемых бактериальных инфекциях в неонатальных и педиатрических отделениях, но примерно у 30% этих пациентов бактериальная инфекция не доказана.

Быстрая диагностика сепсиса у новорожденных и детей проблематична, поскольку клинические признаки вначале малозаметны и неспецифичны. Золотым стандартом диагностики бактериального сепсиса является обычный посев крови. К сожалению, бактериальная культура требует много времени (время получения результатов до 36-72 часов) и недостаточно чувствительности в этой популяции к сепсису. По этой причине детей и младенцев с факторами риска инфекции или клиническими признаками и симптомами инфекции лечат антибиотиками эмпирически при первоначальном подозрении на сепсис, ожидая результатов обычного посева крови. В настоящее время в Нидерландах более 85% сильно недоношенных детей (гестационный возраст <30 недель) получают антибиотики в связи с риском раннего сепсиса (СЭС), а примерно две трети проходят хотя бы один осмотр на предмет позднего сепсиса (ЛОС). ) . Детям более старшего возраста антибиотики часто назначают эмпирически при подозрении на сепсис в ожидании результатов посева крови.

Появляется все больше доказательств того, что, помимо устойчивости к антибиотикам, использование антибиотиков в неонатальном периоде и в детстве изменяет микробиом с повышенным риском немедленных и долгосрочных побочных эффектов, таких как повышенный риск развития астмы, ожирения, аллергии и воспалений. заболевания кишечника (ВЗК). Чтобы избежать ненужного лечения неинфицированных детей, раннее, быстрое, чувствительное и специфическое лабораторное исследование было бы полезно, чтобы помочь врачам решить, когда следует как можно скорее прекратить прием антибиотиков.

Еще одним методом быстрого выявления неонатального сепсиса на более ранней стадии по сравнению с традиционным посевом крови является молекулярное культивирование (МК). MC — это метод быстрого молекулярного культивирования, позволяющий идентифицировать бактерии в течение 4 часов после забора крови. Короче говоря, MC - это метод профилирования на основе ДНК, дифференцирующий виды бактерий на основе видоспецифичных различий в длине нуклеотидов области межспейсера (IS) 16S-23S рДНК с использованием типоспецифичных праймеров для полимеразной цепной реакции (ПЦР) с флуоресцентной меткой. Стандартная процедура MC состоит из двух отдельных ПЦР. В первой ПЦР добавляются два разных праймера: один праймер флуоресцентно маркирует представителей типов Firmicutes, Actinobacter, Fusobacteria и Verrucomicrobia (FAFV), тогда как второй праймер метит членов типа Bacteroidetes. Во второй ПЦР добавляется третий меченый праймер, нацеленный на представителей типа Proteobacteria. Впоследствии эти продукты ПЦР можно амплифицировать и разделить фрагменты ДНК в зависимости от их нуклеотидной длины. В конечном итоге будет создан типичный микробный профиль MC, состоящий из набора пиков с цветовой маркировкой. Каждый пик представляет индивидуальную бактериальную операционную таксономическую единицу (OTU) в зависимости от длины нуклеотидов IS-фрагмента, длина этих пиков демонстрирует концентрацию этой конкретной OTU, тогда как цвета пиков предоставляют информацию о настоящем типе (FAFV, Bacteroidetes или Proteobacteria). .

При бактериальном сепсисе бактерия попадает в стерильный кровоток, вызывая сепсис в результате нарушения регуляции иммунного ответа хозяина и/или реакции бактериальных эндотоксинов. И посев крови, и МК могут обнаруживать бактерии и давать положительный результат (в случае, если бактерия была высеяна) или отрицательный результат (в случае, если бактерии не были обнаружены). В случае положительного результата обоих методов оба метода также показывают, какие бактерии были обнаружены, что можно использовать для изменения режима приема антибиотиков для воздействия на эту конкретную культивируемую бактерию. Однако процесс МК можно завершить в течение 4 часов, что намного короче инкубационного периода культуры крови золотого стандарта, который составляет 36-72 часа. Когда нет сепсиса (и, следовательно, нет бактерий в кровотоке), MC также окажется отрицательным в течение 4 часов и, таким образом, может помочь врачам прекратить прием антибиотиков у неинфицированных детей гораздо быстрее по сравнению с обычным посевом крови.

Культуры крови по-прежнему являются золотым стандартом, но обычно считается, что они обладают низкой чувствительностью для диагностики сепсиса у новорожденных и детей и требуют много времени. Случаи сепсиса могут быть пропущены при посевах, и могут быть полезны более чувствительные диагностические тесты, такие как молекулярные тесты, такие как MC. Достижения в области микробных технологий привели к разработке быстрых молекулярных методов, таких как MC, которые могут быть более чувствительными, чем культура. Для выявления неонатального сепсиса было изучено множество новых молекулярных методов, таких как количественная ПЦР, традиционная ПЦР широкого диапазона и множественная ПЦР. Однако эти методы направлены на конкретные виды, что делает невозможным обнаружение всех видов бактерий. Таким образом, все, что не ищется явно, будет пропущено. Напротив, MC обладает способностью обнаруживать все виды бактерий, которые могут вызывать бактериальный неонатальный сепсис.

Методика MC апробирована для обнаружения этих патогенных бактерий в жидкостях организма. В последние годы была опубликована серия статей, подтверждающих все аспекты техники МК. Кроме того, MC используется в больницах в отделениях интенсивной терапии для обнаружения бактерий в стерильных образцах, таких как кровь, а также в образцах, полученных из абсцессов. Доказательное исследование на 39 новорожденных с подозрением на ЭОС, у которых были взяты дополнительные образцы крови из пуповины, а также при периферической флеботомии, показало, что MC смог обнаружить патогенный бактериальный штамм, который с высокой вероятностью был возбудителем ЭОС. сепсис у одного младенца, который был клинически болен. Традиционная культура не дала никаких результатов для этого пациента. В двух дополнительных образцах MC были обнаружены штаммы, которые могли быть контаминантами у младенцев, которые выглядели клинически хорошо, хотя обычные культуры оставались отрицательными. Других расхождений замечено не было. Это исследование также показало, что MC в образцах крови, в которые были добавлены распространенные бактериальные штаммы для неонатального сепсиса, показали очень высокое согласие с количественной ПЦР в качестве контрольной диагностики. Необходимы более крупные исследования для подтверждения диагностической точности, учитывая очень низкую частоту сепсиса, подтвержденного культурой. .

Результаты другого исследования с использованием метода MC для обнаружения бактерий в жидкостях человеческого организма являются многообещающими. В этом исследовании 66 образцов были собраны и протестированы с помощью традиционной культуры и MC. В 100% образцов с положительной культурой МК также был положительным. В пяти образцах конвенциональная культура оказалась отрицательной, тогда как МК – положительной. Были получены истории болезни этих пяти пациентов, которые показали, что результаты MC имеют высокую клиническую значимость и, следовательно, могут иметь более высокую чувствительность по сравнению с обычным посевом крови.

Таким образом, быстрое обнаружение делает MC потенциально более подготовленным для принятия клинических решений по лечению сепсиса у новорожденных и детей. Однако пригодность MC для этой конкретной группы населения не исследована должным образом. Поэтому необходимо провести высококачественное исследование, чтобы определить диагностическую точность МК при сепсисе у новорожденных и детей и может ли этот метод заменить традиционный посев крови.