瑜伽呼吸改变唾液成分

A. 具体目标

SA1：初步估计结构化的诵经练习刺激健康受试者唾液分泌的程度，唾液分泌中含有可量化的 NGF。

SA2：获得结构化呼吸运动刺激健康受试者唾液分泌的程度的初步估计，唾液分泌中含有可定量的 NGF。

B.背景和意义背景神经退行性疾病诸如阿尔茨海默病的神经退行性疾病是全球主要的医疗保健关注点。 在美国，AD 是第 6 大死因。 遗传和非遗传因素都有助于 AD 的发展。 受 AD 影响的个人需要药物、辅助设备和个人护理等支持，这会带来巨大的情感和经济负担。 AD 与分子水平的显着改变相关，最终转化为细胞、组织、器官和全身功能障碍。 因此，改变细胞功能的分子疗法已成为治疗 AD 的主要临床选择。 例如，NGF，一种参与周围神经系统和中枢神经系统胆碱能神经元发育、维持和存活的营养因子，在 AD 受试者中表现出显着减少。 NGF 的减少导致认知功能显着下降。 因此，给予 NGF 作为 AD 受试者的可行临床选择。 除了这些治疗选择之外，冥想和瑜伽等非药物治疗模式也被认为是治疗 AD 的替代方法。 这种做法和生活方式深深植根于几种古老的文化中。 该项目基于古代泰米尔文化中的两种生活方式健康实践。

NGF 神经生长因子 (NGF) 是一种神经营养蛋白 (MW=13 kDa)。 NGF 由受感觉传入和/或交感传出神经支配的每个组织/器官以及中枢 (CNS) 和外周 (PNS) 神经系统以及免疫细胞产生。 NGF 对于 CNS 中胆碱能神经元的功能完整性以及 PNS 中神经元的发育和功能完整性很重要。 NGF 是免疫系统和上皮来源细胞的存活、分化和营养因子。 唾液腺（下颌下腺/下颌下腺）在人类和小鼠体内产生大量的 NGF。 从小鼠颌下腺产生的 NGF 用于多项临床试验。 在 CNS 中，NGF 在皮层、海马体和垂体中产生；以及其他区域，包括基底神经节、丘脑、脊髓和视网膜。 NGF 与其受体 TrkA 结合并激活有丝分裂 MAPK、PI3K/Akt 和 PLC-γ 通路以介导细胞生长、分化和存活。 NGF 介导的存活对于基底前脑复合体 (BFC) 胆碱能神经元很重要。 这些神经元有助于意识、记忆、注意力和唤醒。 BFC 神经元在 AD 等神经退行性疾病中受到高度影响。 NGF 在实验性创伤模型和与年龄相关的胆碱能下降中保护 BFC 神经元。 由于 NGF 在多个系统中的积极作用，NGF 作为药物的开发正在积极寻求用于治疗神经变性、免疫失调、慢性炎症和自身免疫性疾病。 然而，直到最近，由于痛觉过敏，NGF 的临床试验一直没有取得多大成功。 最近的研究表明，基因疗法、NGF 的鼻腔和眼部给药途径是有效的，而且伤害性副作用要小得多。 此外，最近发现 NGF 的化学修饰可减轻疼痛，这被认为是 NGF 治疗的新方向。 MUSC 正在进行一项 II 期临床试验，评估腺相关病毒介导的 NGF 表达在大脑胆碱能神经元中的有益作用，该项目的共同研究者 Jacobo Mintzer 博士参与其中。

NGF 由神经支配的神经元从靶器官摄取，并通过逆行轴突运输被运输到轴突体。 研究人员使用量子点标记的 NGF 来证明每个 NGF 二聚体在逆行运输过程中被包装到单独的核内体中。 NGF 信号的逆行轴突运输，用于外周交感神经和感觉神经元以及基底前脑胆碱能神经元的存活、分化和维持。 肉毒杆菌毒素遵循逆行途径到达中枢神经元。 此外，最近证实，肉毒杆菌神经毒素 A 和 E 通过运动神经元逆行远距离运输到达神经系统的远端部位，并表明这种机制对于其他神经营养因子的传播也很常见。 这可能解释了为什么 NGF 的鼻内应用被认为对 NGF 治疗有效。 此外，绕过胃肠道途径的舌下吸收途径用于硝酸甘油和其他精神活性药物的应用。 因此，我们的基本原理是唾液腺产生的 NGF 被 1) 神经支配的感觉和运动神经元逆行轴突运输到细胞体和转胞吞作用到达中枢神经元，以及 2) 舌下吸收进入血液的途径到达其他远端靶器官完全在为神经调节剂建立的生产和运输机制的理论框架内。 在此需要强调的是，该提案是首次尝试通过非侵入性方法刺激NGF。

诵经 诵经与歌唱是人类历史上两种古老的文化习俗。 最近的证据表明，这两种做法可以调节呼吸。 声音符号 Om（图 2）被称为幸福生活的单字母钥匙。 Om 是东方宗教中数种吟唱中的一个众所周知的前缀。 唱诵 Om 被认为与身心健康有关。 唱诵 Om 会增加皮肤外周血管阻力，这是即使在生理放松时也能提高精神警觉性的标志。 在大约 40% 的阿尔茨海默病受试者中，缺乏中等潜伏期听觉诱发电位 (MLAEP)。 念诵 Om 被证明可以改善正常受试者的 MLAEP，这表明在 AD 受试者中可以观察到类似的效果。 迷走神经刺激 (VNS) 对 AD 受试者有益，因为它可以增强认知功能。 VNS 的电脉冲显示大脑边缘区域停用。 唱诵 Om 也会引起边缘大脑区域、杏仁核、海马体、海马旁回、脑岛、眶额叶和前扣带皮层以及丘脑的类似失活。 念诵 Om 的神经生理学效应可以通过迷走神经的耳支介导。 然而，尚不清楚特定的分子变化，如 NGF 等神经营养因子，是否会在 Om 吟唱后发生。

呼吸运动 呼吸运动是调节呼吸的一种积极方式。 正常成年人的常见呼吸频率为每分钟 15 次。 该频率随年龄和生理状况而变化。 Bernardi 等人在心力衰竭受试者中表明，放慢呼吸是有益的。 瑜伽、诵经和呼吸练习等运动可以调节呼吸和认知功能。 泰米尔圣人 Thirumoolar 写的 Thirumanthiram 是提到呼吸运动好处的古代文献之一，他的文字以健康和长寿实践而闻名。 呼吸运动被认为会产生氧合和非氧合状态的循环，作为缺血预适应的一种方式。 远程缺血预处理，即在远程器官中诱导短时间的局部缺血，可以防止随后的缺血性损伤。 屏气会增加迷走神经张力，增加副交感神经的优势并减少交感神经的放电。 调节呼吸导致腹式/膈肌呼吸占优势。 因此，呼吸运动可能是诱导神经元缺血预适应的潜在方法。 众所周知，在大脑和心脏中，缺血预处理有利于通过产生细胞存活信号来避免未来的主要缺血事件。 有趣的是，NGF 是一种细胞存活信号分子。 因此可以想象，呼吸运动通过 NGF 的作用诱导中枢和周围神经系统细胞的存活。

唾液作为生物标志物 正常人每天产生约 0.75 至 1.5 升唾液。 唾液含有许多生物活性分子，包括人类和口腔微生物来源的蛋白质、肽、mRNA、DNA 和 miRNA。 唾液分泌调节消化系统、神经系统、免疫系统和呼吸系统。 例如，1) 神经生长因子 (NGF)、P 物质和降钙素基因相关肽 (CGRP) 在唾液中分泌以应对慢性偏头痛，以及 2) Opiorphin，一种有效的抗伤害感受剂在唾液中表达。 唾液蛋白质组学和 mRNA 分析已经确定了对照和癌症受试者之间的显着差异。 这些研究表明，唾液在包括 AD 在内的许多病理状况的诊断和预后中充当生物标志物的来源。

意义 AD 等神经退行性疾病构成了一个主要的全球医疗保健问题。 非药理学和非侵入性实践可以改变正常和病理环境中的神经功能。 神经营养因子的唾液分泌表明唾液可能是神经营养因子的潜在来源和生物标志物。 因此，唾液 NGF 估计可以作为 AD 诊断和预后的工具。 古代泰米尔文化保留了保持健康心理和生理状态的做法。 众所周知，诵经和呼吸运动可以促进唾液分泌。 然而，尚不完全清楚这种做法是否会诱导唾液中神经因子的表达。 我们的目标是量化唾液 NGF 以响应正常人类受试者的吟唱和呼吸运动。 这将在唾液分泌 NGF 的舌头触觉和呼吸信号及其对神经系统的影响之间建立迄今未报道的关系。 我们的项目将在基础、运动期间和运动后量化唾液中的候选神经营养因子 NGF。 在未来的研究中，我们将使用蛋白质组学、肽和基因组学方法来鉴定唾液中由这些练习调节的其他神经营养因子。 我们的研究结果将为患有/易患 AD 和其他神经退行性疾病的个体的治疗和护理引入新的范例。

临床和转化影响：考虑到 AD、衰老和其他神经退行性疾病与神经营养因子生成下降相关（例如 NGF），并且 NGF 作为药物在临床试验中得到积极追求，我们发现 NGF 可以通过简单的、非侵入性的种族实践原位刺激，这将具有强大的临床应用。 未来使用基因组学和蛋白质组学方法的研究将确定唾​​液中的其他神经营养因子，这些因子可能成为治疗 AD 和其他神经退行性疾病的药物靶点。

C. 初步研究 无。 D. 研究设计和方法 人类受试者

共有 20 名年龄在 18 岁及以上的志愿者（男性或女性）将被纳入研究。 以下是排除条件列表：

• 呼吸问题（无法通过鼻孔呼吸、慢性支气管炎、肺气肿和哮喘）
• 会阻止吟唱的言语问题
• 无法倾听和遵循锻炼说明
• 鼻窦充血
• 干燥综合征
• 由于药物或其他情况导致的慢性口干
• 抗胆碱能药物的使用 在完整描述研究后，将获得每位受试者的知情同意。

人类受试者招募一旦我们获得 IRB 批准，我们将通过在 MUSC 电梯和附近的瑜伽中心张贴广告来招募本研究所需的 20 名受试者。 有兴趣的参与者将通过给定的电话号码联系 PI。 PI 将根据问卷中给出的问题评估受试者的资格。 PI 和参与者将商定约会时间。 参与者将来到位于 Strom Thurmond 大楼（STB，222 室）的 PI​​ 实验室。 这间会议室与 PI 的研究实验室位于同一楼层。 我们之所以选择这个房间，是因为它在协议期间不受其他实验室人员的任何干扰，气氛安静。 这个房间是通过 Gazes 心脏研究所实验室经理预订的，PI 可以免费使用。 抵达后，PI 将向受试者解释研究并使用同意书获得同意。 PI 还将在同意书上签名并注明日期，并向参与者提供一份副本。 然后受试者将填写问卷以确认资格。

登记和同意的受试者将被随机分配到 2 种情况之一（“吟唱/呼吸”（CB）臂与“控制”臂。 随机化将与生物统计学家合作进行，并以分层方式（即按性别）进行，以确保 2 个实验组（CB 与对照组）的性别分布相等。 生物统计学家将向 PI 提供包含研究识别号和随机组分配的信封（即 CB 与控制）。 只有在确定研究资格并获得同意后，才会打开每个信封。

在练习和样本采集之前，PI 将教每个主题如何进行诵经和呼吸练习。 每个受试者都将单独进行测试，因为样本采集很容易，并且可以避免在研究人员以外的其他人在场的情况下受试者的神经元刺激可能出现的任何差异。

唱诵、呼吸练习和标本采集 受试者将了解唱诵和呼吸练习。 作为唱诵/瑜伽/呼吸练习练习者，PI 将提供此培训，学习时间不应超过 5 分钟。 收集整个唾液样本的计划如图 3 所示。唾液样本将在协议开始时（时间 0）收集一次，同时受试者就座。 唾液将自然地积聚在口腔中，参与者将其排入带盖的标本管（5 mL 容量）中。

唱诵 Om (C)：

然后受试者将按如下方式唱诵 Om：

1. 通过鼻孔猛烈地深吸气
2. 念诵 Om 时通过嘴巴缓慢呼气。 在这一步，受试者将进行缓慢而完全的呼气。

闭眼连续重复这两个步骤 10 分钟。

呼吸练习（BE）：

唱诵之后，受试者将按照 PI 基于 Thirumanthiram 的指示进行如下呼吸练习：

1. 检查两个鼻孔中的哪一个表现出自由流动的空气。 出于解释目的，空气自由流动的鼻孔被视为鼻孔 1，另一个鼻孔被视为鼻孔 2。
2. 关闭鼻孔 2 并通过鼻孔 1 深吸一口气，然后关闭两个鼻孔，以免吸入的空气逸出。 空气也不应从嘴里逸出。 这个吸入步骤大约需要 4 秒。
3. 在这个位置屏住呼吸约 16 秒。
4. 打开鼻孔 2 并呼气约 8 秒。 需要完全呼气。 当受试者呼气时，腹部会慢慢弯曲。 这是正常的，也是值得鼓励的。 空气不应通过鼻孔 1 或嘴泄漏。
5. 转到步骤 a)。 在运动过程中，如果口腔内积聚唾液，受试者可以在呼气步骤（步骤 d）结束时将其咽下。 受试者将进行 10 分钟的呼吸运动。 唾液样本将在 5 分钟和 10 分钟的呼吸运动时收集在标有 BE-1、BE-2 的试管中。 因此，每个人将提供以下五个唾液样本：+（时间 0）、Om 唱诵（C-1 和 C2）和呼吸练习（BE-1 和 BE-2）。

对照组 在对照组的情况下，受试者将安静地坐着与 CB 组相同的持续时间。 唾液样本将在与 CB 组相同的时间点（以 5 分钟的间隔，持续 20 分钟）收集。

整个协议的大致总时间如下：

简介和问卷 - 10 分钟 唱诵指导、呼吸练习（CB 组）或静坐（对照组）和唾液样本采集 - 10 分钟（CB 组）或 5 分钟（对照组） 基础样本采集 - 1 分钟 Om 唱诵 - 10 分钟 呼吸练习 - 10 分钟 受试者的任何其他问题 - 2-3 分钟 受试者的总预约时间 = 大约 45 分钟（CB 组） 40 分钟（对照组） 对于研究参与者的时间和任何不便，金钱补偿将会给予。

样本处理 将收集到的唾液样本置于冰上。 使用无菌技术，将唾液转移到离心管中，同时测量每个样本的数量。 在实验的每个步骤中从每个样本中收集的样本数量可能会有所不同。 分别处理来自各个试管的样品，不要汇集任何样品。 计算正常休息阶段、念诵期间和呼吸运动期间的唾液总量。 将样品储存在-80 摄氏度直至分析。 数据分析后将丢弃样品。

酶联免疫测定 根据制造商的说明 (Promega)，使用商业试剂盒通过酶联免疫测定对每个样品中的 NGF 水平进行量化。 试剂盒中提供了进行 ELISA 实验所需的所有试剂。 其他试剂（如果有）和 ELISA 阅读器可在 STB 511 室提供给 PI。

数据管理 PI 从参与者那里收集的所有研究数据都将输入 REDCap 数据库，该数据库是在项目生物统计学家的协助下开发的。 REDCap（研究电子数据采集）是一种软件工具集和工作流程方法，用于电子收集和管理 MUSC 研究人员可用的研究和临床试验数据。 迭代开发和测试过程为个别研究制定了精心策划的数据收集策略，这有助于数据输入、编辑检查和最终的统计分析。 底层数据库托管在 MUSC 数据中心，系统受到登录和安全套接字层 (SSL) 加密的保护。

统计分析 统计分析将在生物统计学家的指导下进行，该生物统计学家与 PI 合作开展了这项研究。 最初，描述性统计将用于描述研究参与者的人口统计学特征、任何相关临床特征以及基线和一段时间内的 NGF 测量值。 将酌情通过 t 检验、卡方检验和 Fisher 精确检验来检查人口统计学和其他基线变量的组别差异。 本研究旨在获得这些练习（唱诵和/或呼吸与静息控制）刺激唾液 NGF 有效性的初步证据；因此，不会进行正式的假设检验。 相反，一般线性混合模型 (GLMM) 将用于获得关于 NGF 水平的组差异随时间的估计（及其各自的 95% 置信区间）。 GLMM 是涉及受试者间和受试者内变异性的分析的理想选择，尤其适用于重复测量研究设计，例如用于本拟议研究的设计。 由于年龄被认为会影响 NGF，因此年龄将作为协变量包含在所有模型中。 将考虑时间的线性、二次和三次效应。 将检查不同类型的误差协方差结构，并使用 Akaike 信息准则值来选择最合适的 GLMM。 使用 GLMM 将使我们能够在两种实验条件下描述 NGF 测量值随时间变化的典型轨迹，也将使我们有机会比较 CB 组内的吟唱与呼吸练习。 这种类型的统计模型的结果对于规划（外部资助的）未来、更大规模和更明确的研究将很有价值。

样本量证明 由于不会进行正式的假设检验，因此统计功效与该提案无关；因此，样本量的合理性是基于我们估计过程的精确度，以及在本研究中招募、观察和测量受试者以及以尽可能最有效的方式进行实验室测试所涉及的学习经验。 在每个实验组中有 n=10 个受试者（总共 n=20 个受试者）将使我们能够对每组中随时间推移的 NGF 测量值进行初步估计。 每组 n=10 名受试者时，围绕组均值估计的 95% 置信区间将在任一方向扩展 ~0.6 个标准差，并且围绕平均组差异估计的 95% 置信区间将在任一方向扩展~0.9 个标准差。 每组 n=10，我们还将更好地了解受试者在此类补充和替代医学研究中被随机分配的意愿，以及与提供诵经和呼吸练习干预相关的最佳技术。

E. 人类受试者的保护

1. 受试者的风险 将有 20 名年龄在 18 岁及以上的男性和女性受试者参与这项研究。 该协议将包括针对单个参与者的单次访问、一对一会话。 这些练习不会对参与者造成任何身体、心理和社会风险。 违反保密规定可能是一项潜在风险，因为问卷会收集受试者的健康信息。 在另一个人在场的情况下，参与者可能会觉得吐口水或流口水有点不舒服。 参与者有可能觉得他们事先不知道这些练习，或者他们可能觉得他们不能完全按照练习说明进行操作。

   风险防护 讲师将尽力确保受试者感到轻松自在。 研究中收集的所有信息都将保密处理并存储在如上所述的安全服务器中。 本研究中生成的论文作品包含潜在的个人信息。 这些文件将被保存在一个上锁的柜子里，该柜子属于 PI，位于 MUSC 的 STB 625 房间。 参与者将通过所有文件、数据和唾液样本中的识别号进行识别。 知情同意书是参与者标识号和他们的姓名之间的链接。 收集到的唾液样本将在-80 度冷冻室中用锁固定在机顶盒 213 室，并在数据分析后立即丢弃。 呼吸练习和念诵是温和的运动形式，不会对参与者的健康造成任何风险。 不会联系研究参与者进行另一项研究。

2. 对受试者的潜在健康益处尤其是瑜伽呼吸和一般的瑜伽是有益于健康生活的良好锻炼。 几项研究表明，瑜伽呼吸可以减轻压力并改善多个患者群体和其他健康个体的生活质量。 在研究结束时，由于神经营养作用，唱诵/呼吸运动组的受试者在身体和心理上感觉更好。 这些受试者最终从另一种文化（跨文化体验）中学习新技术来调节呼吸，他们可以根据自己的意愿每天练习，因为从长远来看，持续练习会使他们受益。