Yogisk andning förändrar salivkomponenter

A. SÄRSKILDA MÅL

SA1: Få en preliminär uppskattning av i vilken utsträckning en strukturerad sångövning stimulerar salivsekretion som innehåller kvantifierbara mängder NGF hos friska försökspersoner.

SA2: Få en preliminär uppskattning av i vilken utsträckning en strukturerad andningsövning stimulerar salivsekretion som innehåller kvantifierbara mängder NGF hos friska försökspersoner.

B. BAKGRUND OCH BETYDNING BAKGRUND Neurodegenerativa sjukdomar Neurodegenerativa sjukdomar såsom Alzheimers sjukdom är ett stort hälsoproblem globalt. I USA är AD den sjätte vanligaste dödsorsaken. Både genetiska och icke-genetiska faktorer bidrar till utvecklingen av AD. Individer som drabbats av AD behöver stöd som sträcker sig från mediciner, hjälpmedel och personlig vård som utgör en enorm känslomässig och ekonomisk börda. AD är associerad med betydande förändringar på molekylär nivå som så småningom översätts till cellulär, vävnad, organ och systemisk dysfunktion. Därför har molekylär terapi som förändrar cellfunktioner varit ett viktigt kliniskt alternativ för att behandla AD. Till exempel visar NGF, en trofisk faktor involverad i utvecklingen, underhållet och överlevnaden av det perifera nervsystemet och de kolinerga nervcellerna i det centrala nervsystemet, signifikant minskning hos patienter med AD. Minskningen av NGF orsakar betydande nedgång i kognitiva funktioner. Därför följs administrering av NGF som ett genomförbart kliniskt alternativ för AD-patienter. Utöver dessa terapeutiska alternativ har icke-farmakologiska behandlingsmetoder såsom meditation och yoga ansetts vara alternativa metoder för att behandla AD. Sådana metoder och livsstilar är djupt rotade i flera antika kulturer. Detta projekt är baserat på två livsstilshälsopraktiker från den gamla tamilska kulturen.

NGF nervtillväxtfaktor (NGF) är ett neurotrofiskt protein (MW=13 kDa). NGF produceras av varje vävnad/organ som innerveras av sensoriska afferenter och/eller sympatiska efferenter, såväl som av centrala (CNS) och perifera (PNS) nervsystemet och immunceller. NGF är viktig för den funktionella integriteten hos kolinerga neuroner i CNS och för utvecklingen och funktionella integriteten hos neuroner i PNS. NGF är en överlevnads-, differentierings- och trofiskfaktor för celler i immunsystemet och epitelialt ursprung. Spottkörtlar (submandibulära/submaxillära) producerar en stor mängd NGF hos människor och hos möss. NGF producerad från mus submaxillära körtlar används i flera kliniska prövningar. I CNS produceras NGF i cortex, hippocampus och i hypofysen; och även i andra områden, inklusive de basala ganglierna, thalamus, ryggmärgen och i näthinnan. NGF binder till sin receptor TrkA och aktiverar de mitogena MAPK-, PI3K/Akt- och PLC-gamma-vägarna för att mediera celltillväxt, differentiering och överlevnad. NGF-medierad överlevnad är viktig för de kolinerga nervcellerna i basal framhjärnekomplexet (BFC). Dessa neuroner bidrar till medvetande, minne, uppmärksamhet och upphetsning. BFC-neuroner är starkt påverkade vid neurodegenerativa sjukdomar som AD. NGF skyddar BFC-neuroner i experimentella traumamodeller och i åldersrelaterad kolinerg nedgång. På grund av de positiva effekterna av NGF i flera system, eftersträvas utvecklingen av NGF som ett läkemedel aktivt för behandling av neurodegeneration, immunförstöring, kronisk inflammation och autoimmuna sjukdomar. Men fram till nyligen har kliniska prövningar med NGF varit utan större framgång på grund av hyperalgesi. Nyligen genomförda studier visar att genterapi, nasala och okulära administreringsvägar för NGF är effektiva med mycket mindre nociceptiva biverkningar. Dessutom betraktas en ny upptäckt att kemisk modifiering av NGF minskar smärta som en ny riktning inom NGF-terapi. En klinisk fas II-studie som utvärderar de gynnsamma effekterna av ett adenoassocierat virusmedierat uttryck av NGF i de kolinerga nervcellerna i hjärnan pågår vid MUSC och involverar medutredaren i detta projekt Dr. Jacobo Mintzer.

NGF tas upp från målorganen av de innerverande neuronerna och transporteras till den axonala kroppen genom retrograd axonal transport. Forskare har använt kvantprickmärkt NGF för att visa att varje NGF-dimer är förpackad i individuella endosomer under retrograd transport. Retrograd axonal transport av NGF-signaler för överlevnad, differentiering och underhåll av perifera sympatiska och sensoriska neuroner och basala kolinerga neuroner i framhjärnan. Botulinumtoxin följer en retrograd väg för att nå centrala nervceller. Dessutom har det nyligen bekräftats att botulinumneurotoxiner A och E når distala platser i nervsystemet via retrograd långvägstransport via motorneuroner och föreslog att denna mekanism kan vara vanlig för spridning av andra neurotrofiska faktorer också. Detta kan förklara varför intranasal applicering av NGF anses vara effektiv för NGF-terapi. Dessutom används den sublinguala absorptionsvägen som går förbi gastrointestinal väg för applicering av nitroglycerin och andra psykoaktiva medel. Sålunda, vår motivering att NGF som produceras av spottkörtlarna tas upp av 1) de innerverande sensoriska och motoriska neuronerna för retrograd axonal transport till cellkroppen och transcytos för att nå de centrala neuronerna, och 2) den sublinguala absorptionsvägen in i blodomloppet för att nå andra distala målorgan ligger väl inom den teoretiska ramen för produktions- och transportmekanismer som etablerats för neuromodulatorer. Det ska här betonas att detta förslag är det första försöket någonsin att stimulera NGF med icke-invasiva metoder.

Sång Sång och sång är två uråldriga kulturella metoder i mänsklighetens historia. Nya bevis tyder på att dessa två metoder kan reglera andningen. Ljudsymbolen Om (Figur 2) kallas nyckeln till ett lyckligt liv med en bokstäver. Om är ett välkänt prefix i flera skanderingar i hela österländska religioner. Chanting Om tros vara förknippat med fysiskt och känslomässigt välbefinnande. Chanting Om ökar det kutana perifera vaskulära motståndet, vilket är ett tecken på ökad mental vakenhet även när du är fysiologiskt avslappnad. Hos cirka 40 % av patienterna med Alzheimers saknas den auditory evoked potential (MLAEP) med mitten latency. Chanting Om har visat sig förbättra MLAEP hos normala försökspersoner efter chanting, vilket tyder på att en liknande effekt kan observeras hos AD-personer. Vagal nervstimulering (VNS) var fördelaktigt hos AD-personer eftersom det förbättrar kognitiva funktioner. Elektrisk pulsering för VNS visade deaktivering av limbiska hjärnregioner. Chanting Om orsakade också en liknande deaktivering av de limbiska hjärnområdena, amygdala, hippocampus, parahippocampal gyrus, insula, orbitofrontal och främre cingulate cortices och thalamus. De neurofysiologiska effekterna av att sjunga Om kan förmedlas genom örongrenarna på vagalnerverna. Det är dock inte förstått om specifika molekylära förändringar, i termer av neurotrofiska faktorer som NGF, inträffar efter Om-sjungande.

Andningsträning Andningsträning är ett aktivt sätt att reglera andningen. Vanlig andningsfrekvens är 15 gånger per minut hos normala vuxna människor. Denna frekvens ändras med ålder och fysiologiskt tillstånd. Hos patienter med hjärtsvikt visade Bernardi et al att det var fördelaktigt att bromsa andningen. Övningar som yoga, sång och andningsträning reglerar andning och kognitiva funktioner. En av de gamla texterna som hänvisar till fördelarna med andningsträning är Thirumanthiram skriven av den tamilska vismannen Thirumoolar vars texter är kända för hälsa och livslängd. Andningsträning tros producera cykler av syresättning och icke-syresättningstillstånd som ett sätt för ischemisk förkonditionering. Fjärrstyrd ischemisk förkonditionering, d.v.s. inducering av korta perioder av ischemi i ett avlägset organ ger skydd mot en efterföljande ischemisk förolämpning. Andningshållning ökar vagaltonus, ökar parasympatisk dominans och minskar sympatiska flytningar. Reglerad andning leder till dominans vid buk-/diafragmaandning. Andningsträning kan således vara ett potentiellt sätt att inducera ischemisk förkonditionering i neuronerna. Det är känt i hjärnan och hjärtat att ischemisk förkonditionering är fördelaktig för att avvärja framtida större ischemiska händelser genom att producera cellöverlevnadssignalering. Intressant nog är NGF en signalmolekyl för cellöverlevnad. Därför är det tänkbart att andningsträning inducerar cellöverlevnad i centrala och perifera nervsystemceller via verkan av NGF.

Saliv som biomarkör En normal människa producerar cirka 0,75 till 1,5 L saliv per dag. Saliv innehåller många biologiskt aktiva molekyler inklusive proteiner, peptider, mRNA, DNA och miRNA av både mänskligt och oralt mikrobiellt ursprung. Salivsekretion reglerar matsmältnings-, nerv-, immun- och andningssystemet. Till exempel, 1) Nervtillväxtfaktor (NGF), substans P och kalcitoningenrelaterad peptid (CGRP) utsöndras i saliv som svar på kronisk migrän, och 2) Opiorfin, ett potent antinociceptivt medel, uttrycks i saliv. Saliv proteomisk och mRNA-profilering har identifierat signifikanta skillnader mellan kontroll- och cancerpatienter. Dessa studier indikerar att saliv fungerar som en källa till biomarkörer vid diagnos och prognos för ett antal patologiska tillstånd inklusive AD.

BETYDNING Neurodegenerativa sjukdomar som AD utgör ett stort globalt hälsoproblem. Icke-farmakologiska och icke-invasiva metoder kan förändra neurologiska funktioner i normala och patologiska miljöer. Salivutsöndring av neurotrofiska faktorer indikerar att saliv kan vara en potentiell källa och en biomarkör för neurotrofa faktorer. Därför kan NGF-uppskattning av saliv vara ett verktyg för diagnos och prognos vid AD. Den gamla tamilska kulturen har bevarat metoder för att upprätthålla en hälsosam psykologisk och fysiologisk status. Chansande och andningsövningar är kända för att främja salivsekretion. Det är dock inte helt förstått om sådana metoder inducerar uttryck av neurologiska faktorer i saliven. Vi strävar efter att kvantifiera saliv-NGF som svar på sång och andningsövningar hos normala människor. Detta kommer att etablera ett hittills orapporterat samband mellan tungan taktila och andningssignaler för salivutsöndring av NGF, och dess effekter på nervsystemet. Vårt projekt kommer att kvantifiera kandidat neurotrofisk faktor NGF i saliv vid basal, under och efter träning. I framtida studier kommer vi att använda proteomiska, peptidiska och genomiska metoder för att identifiera andra neurotrofiska faktorer som regleras i saliv av dessa övningar. Våra resultat kommer att introducera ett nytt paradigm inom behandling och vård av individer med/benägna för AD och andra neurodegenerativa sjukdomar.

Klinisk och translationell effekt: Med tanke på det faktum att AD, åldrande och andra neurodegenerativa störningar är förknippade med minskad neurotrofisk faktorproduktion (t. NGF), och att NGF aktivt eftersträvas som ett läkemedel i kliniska prövningar, kommer våra fynd att NGF skulle kunna stimuleras in situ genom enkla, icke-invasiva etniska metoder ha stark klinisk tillämpning. Framtida studier med genomiska och proteomiska tillvägagångssätt kommer att identifiera ytterligare neurotrofiska faktorer i saliv som potentiellt kan vara läkemedelsmål för att behandla AD och andra neurodegenerativa sjukdomar.

C. FÖRSTUDIER Inga. D. FORSKNINGSDESIGN OCH METODER Mänskliga försökspersoner

Totalt 20 frivilliga (man eller kvinna), 18 år och äldre kommer att inkluderas i studien. Följande är en lista över villkor för uteslutning:

• andningsproblem (oförmåga att andas genom näsborrarna, kronisk bronkit, emfysem och astma)
• talproblem som skulle förhindra skandering
• oförmåga att lyssna och följa träningsinstruktioner
• nästäppa
• Sjögrens syndrom
• kronisk muntorrhet på grund av medicinering eller andra tillstånd
• användning av antikolinerga läkemedel Informerat samtycke kommer att erhållas från varje försöksperson efter fullständig beskrivning av studien.

Rekrytering av mänskliga subjekt När vi har fått ett IRB-godkännande kommer vi att rekrytera 20 ämnen som krävs för denna studie genom att publicera en annons i MUSC-hissar och i närliggande yogacenter. Intresserade deltagare kommer att kontakta PI på angivet telefonnummer. Ämnenas behörighet kommer att bedömas av PI baserat på frågor som ges i frågeformuläret. PI och deltagaren kommer överens om en tid för möte. Deltagaren kommer till PI:s labb i Strom Thurmond Building (STB, rum 222). Detta mötesrum ligger på samma våning som PI:s forskningslaboratorium. Vi valde detta rum för dess lugna atmosfär utan störningar från annan labbpersonal under protokollet. Detta rum är reserverat via Gazes Cardiac Research Institute Lab Manager och är fritt tillgängligt för PI. Vid ankomsten kommer PI att förklara studien för försökspersonen och inhämta samtycke med hjälp av samtyckesformuläret. PI kommer också att underteckna och datera samtyckesformuläret och ge en kopia till deltagaren. Ämnet kommer sedan att fylla i frågeformuläret för att bekräfta behörighet.

Inskrivna och godkända försökspersoner kommer att randomiseras till ett av två tillstånd ("Sångande/andning" (CB)-armen kontra "Kontroll"-armen. Randomisering kommer att genomföras i samarbete med en biostatistiker och kommer att ske på ett stratifierat sätt (dvs efter kön), för att säkerställa en jämn könsfördelning i de 2 experimentella grupperna (CB vs. Kontroll). Biostatistikern kommer att förse PI med kuvert som innehåller studiens identifieringsnummer och slumpmässig grupptilldelning (dvs. CB vs kontroll). Varje kuvert kommer att öppnas först efter att studiebehörighet har fastställts och samtycke har erhållits.

Före träning och provtagning kommer PI att lära varje ämne hur man utför sång- och andningsövningar. Varje försöksperson kommer att testa individuellt på grund av enkel provtagning och för att undvika variabilitet som kan uppstå i neuronal stimulering hos försökspersoner i närvaro av andra individer än forskarna.

Sång, andningsövning och provtagning Försökspersonerna kommer att få en introduktion till sång- och andningsövningen. Som utövare av sång/yoga/andningsövningar kommer PI att tillhandahålla denna utbildning, som inte bör ta mer än 5 minuter att lära sig. Planen för att samla in hela salivprover visas i figur 3. Salivprover kommer att samlas in en gång i början av protokollet (tid 0) medan försökspersonerna sitter. Saliv kommer naturligt att tillåtas ackumuleras i munhålan och deltagaren kommer att tömma den i provröret (5 ml kapacitet) med lock.

Chanting Om (C):

Ämnena kommer sedan att sjunga Om enligt följande:

1. Skarp djup inandning genom näsborrarna
2. Långsam utandning genom munnen medan du skanderar Om. I detta steg kommer försökspersonerna att utföra en långsam och fullständig utandning.

Dessa två steg upprepas kontinuerligt i 10 minuter med slutna ögon.

Andningsövning (BE):

Efter skanderingen kommer försökspersonerna att utföra andningsövningen enligt följande, enligt instruktioner från PI baserad på Thirumanthiram:

1. Kontrollera vilken av de två näsborrarna som uppvisar fritt luftflöde. För förklaringsändamålet behandlas näsborren med fritt luftflöde som näsborre 1 och den andra som näsborre 2.
2. Stäng Nostril 2 och andas in ett skarpt djupt andetag genom Nostril 1 och stäng sedan båda näsborrarna så att ingen inandad luft kommer ut. Luft ska inte heller komma ut genom munnen. Detta inandningssteg bör ta cirka 4 sekunder.
3. Håll andan i denna position i cirka 16 sekunder.
4. Öppna Nostril 2 och andas ut i cirka 8 sekunder. Fullständig utandning krävs. Buken kommer långsamt att krökas in när patienten andas ut. Detta är normalt och uppmuntrat. Ingen luft får läcka genom Nostril 1 eller munnen.
5. Gå till steg a). Under träningen, om munhålan samlar saliv, kan försökspersonen svälja den i slutet av utandningssteget (steg d). Försökspersonerna kommer att utföra andningsövningar i 10 min. Salivprover kommer att samlas in vid 5 och 10 minuters andningsträning i rör märkta BE-1, BE-2. Således kommer varje individ att ge följande fem salivprover: + (Tid 0), Om chanting (C-1 och C2) och Andningsövning (BE-1 och BE-2).

Kontrollgrupp När det gäller kontrollgruppen kommer försökspersonerna att sitta tysta under samma tid som CB-gruppen. Salivprover kommer att samlas in vid samma tidpunkter (med 5 minuters intervall i 20 minuter) som CB-gruppen.

Den ungefärliga totala tiden för hela protokollet kommer att vara följande:

Introduktion och frågeformulär - 10 minuter Instruktion för sång, andningsövning (CB-grupp) eller sitta tyst (Kontrollgrupp) och salivprovtagning - 10 minuter (CB-grupp) eller 5 minuter (Kontrollgrupp) Basalprovsamling - 1 minut Om Chanting - 10 minuter Andningsövning - 10 minuter Övriga frågor från försökspersonen - 2-3 minuter Total mötestid för ett ämne = cirka 45 minuter (CB-grupp) 40 minuter (Kontrollgrupp) För studiedeltagarnas tid och eventuella besvär en monetär kompensation kommer att ges.

Bearbetning av prover Lägg de insamlade salivproverna på is. Använd sterila tekniker, överför saliven till centrifugrör samtidigt som du mäter mängden av varje prov. Antalet prover som samlats in från varje prov vid varje steg av experimentet kan variera. Behandla proverna från enskilda rör separat utan att slå ihop något prov. Beräkna den totala salivvolymen under normal vilofas, under sång och under andningsövningar. Förvara proverna vid -80 grader C fram till analys. Prover kommer att kasseras efter dataanalysen.

Enzymkopplad immunanalys Kvantifiera nivåerna av NGF i varje prov genom enzymkopplad immunanalys med kommersiella kit enligt tillverkarens instruktioner (Promega). Alla reagenser som behövs för att genomföra ELISA-experimentet finns i kitet. Eventuella ytterligare reagens och ELISA-läsaren finns tillgängliga för PI i STB-rum 511.

Datahantering All studiedata som samlas in från deltagarna av PI kommer att föras in i en REDCap-databas, utvecklad med hjälp av projektets biostatistiker. REDCap (Research Electronic Data Capture) är en mjukvaruverktygsuppsättning och arbetsflödesmetodik för elektronisk insamling och hantering av forsknings- och kliniska prövningsdata som är tillgängliga för MUSC-forskare. Den iterativa utvecklings- och testprocessen resulterar i en välplanerad datainsamlingsstrategi för enskilda studier som underlättar datainmatning, redigeringskontroller och eventuell statistisk analys. Den underliggande databasen är värd hos MUSC Data Center, och systemet är skyddat bakom en inloggning och Secure Sockets Layer (SSL)-kryptering.

Statistisk analys Statistisk analys kommer att göras under ledning av en biostatistiker, som har samarbetat med PI för att utveckla denna studie. Inledningsvis kommer beskrivande statistik att användas för att karakterisera studiedeltagarna med avseende på demografi, eventuella relevanta kliniska egenskaper och NGF-mätningar vid baslinjen och över tid. Gruppskillnader i demografi och andra baslinjevariabler kommer att undersökas via t-tester, chi-kvadrat-tester och Fishers exakta tester, efter behov. Denna studie är avsedd att erhålla preliminära bevis på effektiviteten av dessa övningar (sång och/eller andning kontra vilokontroll) för att stimulera saliv-NGF; som sådan kommer ingen formell hypotesprövning att genomföras. Istället kommer allmänna linjära blandade modeller (GLMM) att användas för att erhålla uppskattningar (och deras respektive 95 % konfidensintervall) av gruppskillnaderna över tid med avseende på NGF-nivåerna. GLMM:er är idealiska för analyser som involverar variabilitet mellan och inom ämnet och är särskilt användbara för studiedesigner med upprepade mätningar som den som används för denna föreslagna studie. Eftersom ålder tros påverka NGF kommer ålder att inkluderas som en kovariat i alla modeller. Linjära, kvadratiska och kubiska effekter av tid kommer att beaktas. Olika typer av felkovariansstrukturer kommer att undersökas och Akaike Information Criterion-värden kommer att användas för att välja den mest lämpliga GLMM. Att använda GLMM kommer att tillåta oss att karakterisera den typiska banan för NGF-mätningar över tid i båda experimentella förhållanden och kommer också att ge oss möjlighet att jämföra sång- och andningsövningar inom CB-gruppen. Resultat från denna typ av statistisk modellering kommer att vara värdefulla för planering (externt finansierade) framtida, större och mer definitiva studier.

Urvalsstorlek Motivering Eftersom ingen formell hypotesprövning kommer att utföras är statistisk styrka inte relevant för detta förslag. sålunda är motiveringen för urvalsstorleken baserad på precisionen i våra uppskattningsprocesser och på inlärningserfarenheterna med att registrera, observera och mäta försökspersonerna i denna studie samt att genomföra laboratorietester på ett så effektivt sätt som möjligt. Att ha n=10 försökspersoner i varje experimentgrupp (för totalt n=20 försökspersoner) kommer att tillåta oss att göra preliminära uppskattningar av NGF-mätningarna över tiden i varje grupp. Med n=10 försökspersoner per grupp kommer 95 % konfidensintervall runt gruppmedelvärdeskattningar att förlänga ~0,6 standardavvikelser i endera riktningen, och 95 % konfidensintervall runt genomsnittliga gruppskillnadsuppskattningar kommer att förlänga ~0,9 standardavvikelser i endera riktningen. Med n=10 per grupp kommer vi också att få en större förståelse för försökspersoners vilja att bli randomiserad i denna typ av komplementära och alternativmedicinska studier och för de bästa teknikerna förknippade med att leverera sång- och andningsövningar.

E. SKYDD AV MÄNNISKA ÄMNEN

1. Risker för försökspersonerna Det kommer att finnas 20 försökspersoner, både män och kvinnor, som deltar i denna studie som är i åldersgruppen 18 och uppåt. Detta protokoll kommer att bestå av enstaka besök, en-mot-en-sessioner för enskilda deltagare. Dessa övningar utgör inga fysiska, psykiska, sociala risker för deltagarna. Brott mot konfidentialitet kan vara en potentiell risk eftersom frågeformuläret samlar in hälsoinformation om försökspersonerna. Deltagarna kan känna sig lite obekväma att spotta eller dregla i närvaro av en annan individ. Det finns en chans för deltagaren att känna att de inte kan övningarna i förväg eller så kan de känna att de inte är fullt kapabla att följa övningsinstruktionerna.

   Skydd mot risker Instruktören kommer att försöka se till att försökspersonerna känner sig bekväma och bekväma. All information som samlas in i studien kommer att behandlas konfidentiellt och lagras på säkrade servrar enligt beskrivningen ovan. Pappersverken som genereras i denna studie innehåller potentiell personlig information. Dessa dokument kommer att förvaras i ett låst skåp som tillhör PI som finns i rum 625 i STB vid MUSC. Deltagarna kommer att identifieras med ett identifikationsnummer i alla dokument, data och i salivprover. Det informerade samtycket är länken mellan deltagarens identifieringsnummer och deras namn. De insamlade salivproverna kommer att säkras vid -80 graders frys med lås i STB-rum 213 och kasseras omedelbart efter dataanalysen. Andningsövningarna och skanderingen är milda träningsformer och utgör inga hälsorisker för deltagarna. Studiedeltagarna kommer inte att kontaktas för en annan studie.

2. Potentiella hälsofördelar för ämnena Yogisk andning i synnerhet och yoga i allmänhet är bra övningar för ett hälsosamt liv. Flera studier tyder på att yogisk andning minskar stress och förbättrar livskvaliteten hos flera patientgrupper och hos i övrigt friska individer. I slutet av studien kunde försökspersonerna under gruppen Chanting/Andningsövningar må fysiskt och psykiskt bättre på grund av de neurotrofiska effekterna. Dessa ämnen slutar med att lära sig nya tekniker från en annan kultur (tvärkulturell erfarenhet) för att reglera andning som de kan träna dagligen efter sin vilja eftersom kontinuerlig träning skulle kunna gynna dem på lång sikt.