A respiração iogue altera os componentes salivares

A. OBJETIVOS ESPECÍFICOS

SA1: Obtenha uma estimativa preliminar da extensão em que um exercício de canto estruturado estimula a secreção salivar que contém quantidades quantificáveis ​​de NGF em indivíduos saudáveis.

SA2: Obtenha uma estimativa preliminar da extensão em que um exercício de respiração estruturada estimula a secreção salivar que contém quantidades quantificáveis ​​de NGF em indivíduos saudáveis.

B. ANTECEDENTES E SIGNIFICADO ANTECEDENTES Doenças neurodegenerativas As doenças neurodegenerativas, como a doença de Alzheimer, são uma grande preocupação de saúde em todo o mundo. Nos EUA, a DA é a 6ª principal causa de morte. Fatores genéticos e não genéticos contribuem para o desenvolvimento da DA. Indivíduos afetados com DA precisam de suportes que vão desde medicamentos, dispositivos auxiliares e cuidados pessoais que representam um enorme fardo emocional e financeiro. A DA está associada a alterações significativas a nível molecular que acabam por se traduzir em disfunções celulares, tecidulares, orgânicas e sistémicas. Portanto, a terapia molecular que altera as funções celulares tem sido uma opção clínica importante para o tratamento da DA. Por exemplo, o NGF, um fator trófico envolvido no desenvolvimento, manutenção e sobrevivência do sistema nervoso periférico e dos neurônios colinérgicos do sistema nervoso central, apresenta redução significativa em indivíduos com DA. A redução do NGF causa declínio significativo nas funções cognitivas. Portanto, a administração de NGF é seguida como uma opção clínica viável para indivíduos com DA. Além dessas opções terapêuticas, modos não farmacológicos de tratamento, como meditação e ioga, têm sido considerados abordagens alternativas para o tratamento da DA. Tais práticas e estilos de vida estão profundamente enraizados em várias culturas antigas. Este projeto é baseado em duas práticas de saúde de estilo de vida da antiga cultura Tamil.

NGF O fator de crescimento nervoso (NGF) é uma proteína neurotrófica (MW=13 kDa). O NGF é produzido por todos os tecidos/órgãos que são inervados por aferentes sensoriais e/ou eferentes simpáticos, bem como pelo sistema nervoso central (SNC) e periférico (SNP) e células imunes. O NGF é importante para a integridade funcional dos neurônios colinérgicos no SNC e para o desenvolvimento e integridade funcional dos neurônios no SNP. O NGF é um fator de sobrevivência, diferenciação e trófico para células do sistema imune e de origem epitelial. As glândulas salivares (submandibular/submaxilar) produzem uma grande quantidade de NGF em humanos e camundongos. O NGF produzido a partir de glândulas submaxilares de camundongos é usado em vários ensaios clínicos. No SNC, o NGF é produzido no córtex, no hipocampo e na glândula pituitária; e também em outras áreas, incluindo os gânglios da base, tálamo, medula espinhal e na retina. O NGF se liga ao seu receptor TrkA e ativa as vias mitogênicas MAPK, PI3K/Akt e PLC-gama para mediar o crescimento, diferenciação e sobrevivência celular. A sobrevivência mediada por NGF é importante para os neurônios colinérgicos do complexo prosencéfalo basal (BFC). Esses neurônios contribuem para a consciência, memória, atenção e excitação. Os neurônios BFC são altamente afetados em doenças neurodegenerativas, como a DA. O NGF protege os neurônios do BFC em modelos experimentais de trauma e no declínio colinérgico associado à idade. Devido aos efeitos positivos do NGF em vários sistemas, o desenvolvimento do NGF como medicamento é buscado ativamente para o tratamento de neurodegeneração, desregulação imunológica, inflamação crônica e doenças autoimunes. No entanto, até recentemente, os ensaios clínicos com NGF não tiveram muito sucesso devido à hiperalgesia. Estudos recentes mostram que a terapia gênica, as vias nasal e ocular de administração de NGF são eficazes com muito menos efeitos colaterais nociceptivos. Além disso, uma descoberta recente de que a modificação química do NGF reduz a dor é considerada uma nova direção na terapia com NGF. Um ensaio clínico de Fase II avaliando os efeitos benéficos de uma expressão mediada por vírus adeno-associado de NGF nos neurônios colinérgicos do cérebro está em andamento no MUSC envolvendo o co-investigador deste projeto, Dr. Jacobo Mintzer.

O NGF é captado dos órgãos-alvo pelos neurônios inervados e transportado para o corpo axonal por transporte axonal retrógrado. Os pesquisadores usaram NGF marcado com pontos quânticos para mostrar que cada dímero de NGF é empacotado em endossomos individuais durante o transporte retrógrado. Transporte axonal retrógrado de sinais de NGF para a sobrevivência, diferenciação e manutenção de neurônios sensoriais e simpáticos periféricos e neurônios colinérgicos do prosencéfalo basal. A toxina botulínica segue uma via retrógrada para atingir os neurônios centrais. Além disso, foi recentemente confirmado que as neurotoxinas botulínicas A e E atingem locais distais no sistema nervoso por meio de transporte retrógrado de longo alcance via neurônios motores e sugeriu que esse mecanismo também pode ser comum para a disseminação de outros fatores neurotróficos. Isso pode explicar por que a aplicação intranasal de NGF é considerada eficaz para a terapia com NGF. Além disso, a via de absorção sublingual que contorna a via gastrointestinal é utilizada para a aplicação de nitroglicerina e outros agentes psicoativos. Assim, nosso raciocínio de que o NGF produzido pelas glândulas salivares é captado por 1) os neurônios sensoriais e motores inervadores para transporte axonal retrógrado para o corpo celular e transcitose para atingir os neurônios centrais e 2) a rota de absorção sublingual na corrente sanguínea para alcançar outros órgãos-alvo distais está bem dentro da estrutura teórica dos mecanismos de produção e transporte estabelecidos para neuromoduladores. Deve ser enfatizado aqui que esta proposta é a primeira tentativa de estimular o NGF por métodos não invasivos.

Cantar Cantar e cantar são duas antigas práticas culturais na história da humanidade. Evidências recentes sugerem que essas duas práticas podem regular a respiração. O símbolo sonoro Om (Figura 2) é referido como a chave de uma letra para uma vida feliz. Om é um prefixo bem conhecido em vários cânticos nas religiões orientais. Acredita-se que cantar Om esteja associado ao bem-estar físico e emocional. Cantar Om aumenta a resistência vascular periférica cutânea, o que é um sinal de alerta mental aumentado, mesmo estando fisiologicamente relaxado. Em cerca de 40% dos indivíduos com Alzheimer, o potencial evocado auditivo de média latência (PEAML) está ausente. Cantar Om demonstrou melhorar o PEAML em indivíduos normais após cantar, sugerindo que um efeito semelhante pode ser observado em indivíduos com DA. A estimulação do nervo vago (VNS) foi benéfica em indivíduos com DA, pois melhora as funções cognitivas. A pulsação elétrica para VNS mostrou desativação de regiões límbicas do cérebro. Cantar Om também causou uma desativação semelhante das regiões límbicas do cérebro, amígdala, hipocampo, giro para-hipocampal, ínsula, córtex orbitofrontal e cingulado anterior e tálamo. Os efeitos neurofisiológicos de cantar Om podem ser mediados através dos ramos auriculares dos nervos vagais. No entanto, não se sabe se alterações moleculares específicas, em termos de fatores neurotróficos como o NGF, ocorrem após o canto do Om.

Exercícios respiratórios Os exercícios respiratórios são uma forma ativa de regular a respiração. A frequência respiratória comum é de 15 vezes por minuto em humanos adultos normais. Essa frequência muda com a idade e condição fisiológica. Em indivíduos com insuficiência cardíaca, Bernardi et al mostraram que diminuir a respiração é benéfico. Exercícios como ioga, cânticos e exercícios respiratórios regulam a respiração e as funções cognitivas. Um dos textos antigos que se refere aos benefícios do exercício respiratório é Thirumanthiram, escrito pelo sábio tâmil Thirumoolar, cujos textos são conhecidos por práticas de saúde e longevidade. Acredita-se que o exercício respiratório produza ciclos de oxigenação e estados de não oxigenação como um meio de pré-condicionamento isquêmico. O pré-condicionamento isquêmico remoto, ou seja, a indução de curtos períodos de isquemia em um órgão remoto fornece proteção contra um insulto isquêmico subsequente. A suspensão da respiração aumenta o tônus ​​vagal, aumenta a dominância parassimpática e diminui as descargas simpáticas. A respiração regulada leva à predominância da respiração abdominal/diafragmática. Assim, o exercício respiratório pode ser uma forma potencial de induzir o pré-condicionamento isquêmico nos neurônios. É conhecido no cérebro e no coração que o pré-condicionamento isquêmico é benéfico na prevenção de eventos isquêmicos graves futuros, produzindo sinalização de sobrevivência celular. Curiosamente, o NGF é uma molécula sinalizadora de sobrevivência celular. Portanto, é concebível que o exercício respiratório induza a sobrevivência celular nas células do sistema nervoso central e periférico por meio das ações do NGF.

A saliva como um biomarcador Um ser humano normal produz cerca de 0,75 a 1,5 L de saliva por dia. A saliva contém numerosas moléculas biologicamente ativas, incluindo proteínas, peptídeos, mRNA, DNA e miRNA de origem microbiana oral e humana. A secreção salivar regula os sistemas digestivo, nervoso, imunológico e respiratório. Por exemplo, 1) Fator de crescimento nervoso (NGF), substância P e peptídeo relacionado ao gene da calcitonina (CGRP) são secretados na saliva em resposta à enxaqueca crônica e 2) Opiorfina, um potente agente antinociceptivo, é expresso na saliva. A proteômica salivar e o perfil de mRNA identificaram diferenças significativas entre controles e indivíduos com câncer. Esses estudos indicam que a saliva serve como fonte de biomarcadores no diagnóstico e prognóstico de várias condições patológicas, incluindo a DA.

SIGNIFICADO As doenças neurodegenerativas, como a DA, constituem um importante problema global de saúde. Práticas não farmacológicas e não invasivas podem alterar as funções neurológicas em ambientes normais e patológicos. A secreção salivar de fatores neurotróficos indica que a saliva pode ser uma fonte potencial e um biomarcador para fatores neurotróficos. Portanto, a estimativa de NGF salivar pode ser uma ferramenta para diagnóstico e prognóstico na DA. A antiga cultura tâmil preservou práticas para manter um estado psicológico e fisiológico saudável. O canto e o exercício respiratório são conhecidos por promover a secreção salivar. No entanto, não é totalmente compreendido se tais práticas induzem a expressão de fatores neurológicos na saliva. Nosso objetivo é quantificar o NGF salivar em resposta ao canto e ao exercício respiratório em seres humanos normais. Isso estabelecerá uma relação até então não relatada entre os sinais táteis e respiratórios da língua para a secreção salivar de NGF e seus efeitos no sistema nervoso. Nosso projeto quantificará o candidato a fator neurotrófico NGF na saliva no basal, durante e pós-exercício. Em estudos futuros usaremos abordagens proteômicas, peptídicas e genômicas para identificar outros fatores neurotróficos regulados na saliva por esses exercícios. Nossas descobertas introduzirão um novo paradigma no tratamento e cuidado de indivíduos com/propensos a DA e outras doenças neurodegenerativas.

Impacto clínico e translacional: Dado o fato de que a DA, o envelhecimento e outros distúrbios neurodegenerativos estão associados à diminuição da produção de fatores neurotróficos (por exemplo, NGF) e que o NGF é ativamente buscado como medicamento em ensaios clínicos, nossas descobertas de que o NGF pode ser estimulado in situ por práticas étnicas simples e não invasivas terão forte aplicação clínica. Estudos futuros usando abordagens genômicas e proteômicas identificarão fatores neurotróficos adicionais na saliva que poderiam ser alvos de drogas para tratar a DA e outras doenças neurodegenerativas.

C. ESTUDOS PRELIMINARES Nenhum. D. PROJETO DE PESQUISA E MÉTODOS Seres humanos

Um total de 20 voluntários (homens ou mulheres), com 18 anos ou mais, serão incluídos no estudo. A seguir está uma lista de condições para exclusão:

• problemas respiratórios (incapacidade de respirar pelas narinas, bronquite crônica, enfisema e asma)
• problemas de fala que impediriam o canto
• incapacidade de ouvir e seguir instruções de exercícios
• congestão nasal
• síndrome de Sjogren
• boca seca crônica devido a medicamentos ou outras condições
• uso de medicamentos anticolinérgicos O consentimento informado será obtido de cada sujeito após a descrição completa do estudo.

Recrutamento de participantes humanos Assim que obtivermos a aprovação do IRB, recrutaremos os 20 participantes necessários para este estudo, colocando um anúncio nos elevadores do MUSC e em centros de ioga próximos. Os participantes interessados ​​entrarão em contato com o PI no número de telefone fornecido. A elegibilidade dos participantes será avaliada pelo PI com base nas perguntas fornecidas no Questionário. O PI e o participante acordarão um horário de consulta. O participante virá ao laboratório do PI no Edifício Strom Thurmond (STB, Sala 222). Esta sala de reuniões está localizada no mesmo andar do laboratório de pesquisa do PI. Escolhemos esta sala por sua atmosfera silenciosa, sem qualquer interferência de outros funcionários do laboratório durante o protocolo. Esta sala é reservada através do Gazes Cardiac Research Institute Lab Manager e está disponível gratuitamente para o PI. Ao chegar, o PI explicará o estudo ao sujeito e obterá o consentimento usando o Formulário de Consentimento. O PI também assinará e datará o Termo de Consentimento e dará uma cópia ao participante. O sujeito então preencherá o Questionário para confirmar a elegibilidade.

Os indivíduos inscritos e consentidos serão randomizados para uma das 2 condições (o braço "Canto/Respiração" (CB) versus o braço "Controle". A randomização será conduzida em colaboração com um bioestatístico e será feita de maneira estratificada (ou seja, por gênero), para garantir a distribuição igual de gênero nos 2 grupos experimentais (CB vs. Controle). O bioestatístico fornecerá ao PI envelopes contendo o número de identificação do estudo e a atribuição aleatória do grupo (ou seja, CB vs. Controle). Cada envelope será aberto somente após a elegibilidade do estudo ser estabelecida e o consentimento obtido.

Antes do exercício e da coleta de amostras, o PI ensinará a cada sujeito como realizar exercícios de canto e respiração. Cada sujeito será testado individualmente devido à facilidade de coleta de amostras e para evitar qualquer variabilidade que possa surgir na estimulação neuronal em sujeitos na presença de outros indivíduos que não os pesquisadores.

Canto, Exercício de Respiração e Coleta de Amostras Os sujeitos receberão uma introdução ao exercício de canto e respiração. Como praticante de canto/yoga/exercícios respiratórios, o PI ministrará este treino, que não deverá demorar mais de 5 minutos a aprender. O plano de coleta de amostras de saliva total está representado na Figura 3. As amostras de saliva serão coletadas uma vez no início do protocolo (Tempo 0) enquanto os sujeitos estiverem sentados. A saliva será naturalmente acumulada na cavidade oral e o participante a descarregará no tubo de amostra (capacidade de 5 mL) com tampa.

Cantando Om (C):

Os sujeitos então cantarão Om da seguinte forma:

1. Inalação profunda aguda pelas narinas
2. Expiração lenta pela boca enquanto entoa Om. Nesta etapa, os sujeitos realizarão uma expiração lenta e completa.

Essas duas etapas são repetidas continuamente por 10 minutos com os olhos fechados.

Exercício Respiratório (BE):

Após o canto, os sujeitos realizarão o exercício respiratório da seguinte forma, conforme instruções do PI com base no Thirumanthiram:

1. Verifique qual das duas narinas apresenta livre fluxo de ar. Para fins de explicação, a narina com fluxo livre de ar é tratada como Narina 1 e a outra como Narina 2.
2. Feche a narina 2 e inspire profundamente pela narina 1 e, em seguida, feche ambas as narinas para que o ar inalado não escape. O ar também não deve escapar pela boca. Esta etapa de inalação deve levar cerca de 4 segundos.
3. Prenda a respiração nesta posição por cerca de 16 segundos.
4. Abra a Narina 2 e expire por cerca de 8 segundos. A expiração completa é necessária. O abdômen se curvará lentamente à medida que o sujeito expira. Isso é normal e encorajado. Nenhum ar deve vazar pela Narina 1 ou pela boca.
5. Vá para a etapa a). Durante o exercício, se a cavidade oral acumular saliva, o sujeito pode degluti-la ao final da etapa expiratória (Etapa d). Os sujeitos realizarão exercício respiratório por 10 min. Amostras salivares serão coletadas aos 5 e 10 minutos de exercício respiratório em tubos rotulados como BE-1, BE-2. Assim, cada indivíduo fornecerá as seguintes cinco amostras de saliva: + (Tempo 0), canto Om (C-1 e C2) e Exercício Respiratório (BE-1 e BE-2).

Grupo de controle No caso do grupo de controle, os sujeitos permanecerão sentados em silêncio pelo mesmo tempo que o grupo CB. As amostras de saliva serão coletadas nos mesmos pontos de tempo (em intervalos de 5 min por 20 min) que o grupo CB.

O tempo total aproximado para todo o protocolo será o seguinte:

Introdução e Questionário - 10 minutos Instrução para canto, exercício respiratório (grupo CB) ou sentar quieto (grupo controle) e coleta de amostra salivar - 10 minutos (grupo CB) ou 5 minutos (grupo controle) Coleta de amostra basal - 1 minuto Om Chanting - 10 minutos de Exercício Respiratório - 10 minutos Qualquer outra pergunta do sujeito - 2-3 minutos Tempo total da consulta para um sujeito = aproximadamente 45 minutos (grupo CB) 40 minutos (grupo de controle) Pelo tempo dos participantes do estudo e qualquer inconveniente uma compensação monetária será fornecido.

Processamento de amostras Coloque as amostras de saliva coletadas no gelo. Usando técnicas estéreis, transfira a saliva para tubos de centrífuga enquanto mede a quantidade de cada amostra. O número de amostras coletadas de cada amostra em cada etapa do experimento pode variar. Trate as amostras de tubos individuais separadamente sem agrupar nenhuma amostra. Calcule o volume total de saliva durante a fase normal de repouso, durante o canto e durante o exercício respiratório. Armazene as amostras a -80 graus C até a análise. As amostras serão descartadas após a análise dos dados.

Imunoensaio enzimático Quantifique os níveis de NGF em cada amostra por imunoensaio enzimático usando kits comerciais de acordo com as instruções do fabricante (Promega). Todos os reagentes necessários para realizar o experimento ELISA são fornecidos no kit. Reagentes adicionais, se houver, e o leitor ELISA estão disponíveis para o PI no STB Room 511.

Gerenciamento de dados Todos os dados do estudo coletados dos participantes pelo PI serão inseridos em um banco de dados REDCap, desenvolvido com a assistência do bioestatístico do projeto. REDCap (Research Electronic Data Capture) é um conjunto de ferramentas de software e metodologia de fluxo de trabalho para coleta e gerenciamento eletrônico de dados de pesquisas e ensaios clínicos disponíveis para pesquisadores do MUSC. O desenvolvimento iterativo e o processo de teste resultam em uma estratégia de coleta de dados bem planejada para estudos individuais que facilita a entrada de dados, verificações de edição e eventual análise estatística. O banco de dados subjacente é hospedado no MUSC Data Center e o sistema é protegido por login e criptografia Secure Sockets Layer (SSL).

Análise estatística A análise estatística será feita sob a orientação de um bioestatístico, que colaborou com o PI no desenvolvimento deste estudo. Inicialmente, estatísticas descritivas serão usadas para caracterizar os participantes do estudo com relação a dados demográficos, quaisquer características clínicas relevantes e medições de NGF no início e ao longo do tempo. As diferenças de grupo em dados demográficos e outras variáveis ​​de linha de base serão examinadas por meio de testes t, testes qui-quadrado e testes exatos de Fisher, conforme apropriado. Este estudo destina-se a obter evidências preliminares da eficácia desses exercícios (canto e/ou controle da respiração versus repouso) para estimular o NGF salivar; como tal, nenhum teste de hipótese formal será conduzido. Em vez disso, modelos lineares mistos gerais (GLMMs) serão usados ​​para obter estimativas (e seus respectivos intervalos de confiança de 95%) das diferenças de grupo ao longo do tempo com relação aos níveis de NGF. GLMMs são ideais para análises envolvendo variabilidade entre e dentro do assunto e são especialmente úteis para projetos de estudo de medidas repetidas, como o usado para este estudo proposto. Uma vez que se acredita que a idade afeta o NGF, a idade será incluída como uma covariável em todos os modelos. Efeitos lineares, quadráticos e cúbicos do tempo serão considerados. Diferentes tipos de estruturas de covariância de erro serão examinados e os valores do Critério de Informação de Akaike serão usados ​​para selecionar o GLMM mais adequado. O uso do GLMM nos permitirá caracterizar a trajetória típica das medições de NGF ao longo do tempo em ambas as condições experimentais e também nos dará a oportunidade de comparar cantos versus exercícios respiratórios no grupo CB. Os resultados desse tipo de modelagem estatística serão valiosos para o planejamento (financiado externamente) de estudos futuros maiores e mais definitivos.

Justificativa do Tamanho da Amostra Como nenhum teste de hipótese formal será realizado, o poder estatístico não é relevante para esta proposta; assim, a justificativa do tamanho da amostra é baseada na precisão de nossos processos de estimativa e nas experiências de aprendizado envolvidas com a inscrição, observação e medição dos sujeitos deste estudo, bem como na condução dos testes laboratoriais da maneira mais eficiente possível. Ter n=10 indivíduos em cada grupo experimental (para um total de n=20 indivíduos) nos permitirá fazer estimativas preliminares das medições de NGF ao longo do tempo em cada grupo. Com n = 10 indivíduos por grupo, os intervalos de confiança de 95% em torno das estimativas médias do grupo estenderão ~0,6 desvios padrão em qualquer direção e os intervalos de confiança de 95% em torno das estimativas de diferença média do grupo estenderão ~0,9 desvios padrão em qualquer direção. Com n = 10 por grupo, também obteremos uma maior compreensão da disposição dos indivíduos de serem randomizados neste tipo de estudo de medicina complementar e alternativa e das melhores técnicas associadas à aplicação de cantos e intervenções de exercícios respiratórios.

E. PROTEÇÃO DE PESSOAS HUMANAS

1. Riscos para os participantes Haverá 20 participantes, homens e mulheres, neste estudo, na faixa etária de 18 anos ou mais. Este protocolo consistirá em visitas únicas, sessões individuais para cada participante. Esses exercícios não representam riscos físicos, psicológicos e sociais para os participantes. A quebra de confidencialidade pode ser um risco potencial, pois o Questionário coleta informações de saúde dos participantes. Os participantes podem se sentir um pouco desconfortáveis ​​para cuspir ou babar na presença de outro indivíduo. Existe a chance de o participante sentir que não conhece os exercícios de antemão ou pode sentir que não é totalmente capaz de seguir as instruções dos exercícios.

   Proteções contra riscos O instrutor tentará garantir que os participantes se sintam à vontade e confortáveis. Todas as informações coletadas no estudo serão tratadas com confidencialidade e armazenadas em servidores seguros conforme descrito acima. Os trabalhos em papel gerados no presente estudo contêm informações pessoais em potencial. Esses documentos serão guardados em um armário trancado pertencente ao PI localizado na sala 625 do STB no MUSC. Os participantes serão identificados por um número de identificação em todos os documentos, dados e nas amostras de saliva. O Termo de Consentimento Livre e Esclarecido é o elo entre o número de identificação do participante e seu nome. As amostras de saliva coletadas serão armazenadas em freezer a -80 graus com fechadura na sala STB 213 e descartadas imediatamente após a análise dos dados. Os exercícios respiratórios e o canto são formas de exercícios leves e não representam nenhum risco à saúde dos participantes. Os participantes do estudo não serão contatados para outro estudo.

2. Potenciais benefícios para a saúde dos participantes A respiração iogue em particular e a ioga em geral são bons exercícios para uma vida saudável. Vários estudos indicam que a respiração iogue reduz o estresse e melhora a qualidade de vida em vários grupos de pacientes e em indivíduos saudáveis. No final do estudo, os participantes do grupo Canto/Exercício Respiratório puderam se sentir fisicamente e psicologicamente melhor por causa dos efeitos neurotróficos. Esses sujeitos acabam aprendendo novas técnicas de outra cultura (experiência transcultural) para regular a respiração que podem praticar diariamente à vontade, pois a prática contínua pode beneficiá-los a longo prazo.