ヨガの呼吸は唾液成分を変化させる

A. 特定の目的

SA1: 構造化された詠唱エクササイズが、健康な被験者において定量可能な量の NGF を含む唾液分泌を刺激する程度の予備的推定値を取得します。

SA2: 構造化された呼吸運動が、健康な被験者において定量可能な量の NGF を含む唾液分泌を刺激する程度の予備的推定を取得します。

B. 背景および重要性 背景 神経変性疾患 アルツハイマー病などの神経変性疾患は、世界的に主要な健康問題です。 米国では、アルツハイマー病は 6 番目に多い死因です。 遺伝的要因と非遺伝的要因の両方がADの発症に寄与しています。 アルツハイマー病に罹患した個人は、投薬、補助器具、身の回りの世話に至るまで、多大な精神的および経済的負担をもたらす支援を必要としています。 ADは、最終的に細胞、組織、器官、および全身の機能不全につながる分子レベルでの重大な変化と関連しています。 したがって、細胞機能を変更する分子療法は、AD を治療するための主要な臨床オプションとなっています。 例えば、末梢神経系および中枢神経系のコリン作動性ニューロンの発達、維持および生存に関与する栄養因子であるNGFは、AD患者において有意な減少を示す。 NGF の減少は、認知機能の大幅な低下を引き起こします。 したがって、NGF の投与は、AD 患者の実行可能な臨床オプションとして行われます。 これらの治療オプションに加えて、瞑想やヨガなどの非薬理学的治療法が、アルツハイマー病を治療するための代替アプローチとして検討されてきました。 そのような習慣や生活様式は、いくつかの古代文化に深く根ざしています。 このプロジェクトは、古代タミル文化の 2 つのライフスタイルの健康法に基づいています。

NGF 神経成長因子 (NGF) は神経栄養タンパク質 (MW=13 kDa) です。 NGF は、感覚求心性神経および/または交感神経遠心性神経、ならびに中枢 (CNS) および末梢 (PNS) 神経系、および免疫細胞によって神経支配されるすべての組織/器官によって生成されます。 NGF は、CNS のコリン作動性ニューロンの機能的完全性、および PNS のニューロンの発達と機能的完全性にとって重要です。 NGF は、免疫系および上皮起源の細胞の生存、分化、および栄養因子です。 唾液腺 (顎下/顎下) は、ヒトおよびマウスで大量の NGF を生成します。 マウス顎下腺から生成された NGF は、いくつかの臨床試験で使用されています。 中枢神経系では、NGF は皮質、海馬、および下垂体で産生されます。また、大脳基底核、視床、脊髄、網膜を含む他の領域でも。 NGF はその受容体である TrkA に結合し、マイトジェン MAPK、PI3K/Akt、および PLC-γ 経路を活性化して、細胞の増殖、分化、および生存を媒介します。 NGF を介した生存は、基底前脳複合体 (BFC) コリン作動性ニューロンにとって重要です。 これらのニューロンは、意識、記憶、注意、覚醒に寄与しています。 BFC ニューロンは、AD などの神経変性疾患に大きく影響されます。 NGF は、実験的外傷モデルおよび加齢に伴うコリン作動性低下において BFC ニューロンを保護します。 複数のシステムにおける NGF のプラスの効果により、神経変性、免疫調節不全、慢性炎症、および自己免疫疾患を治療するための薬剤としての NGF の開発が積極的に追求されています。 しかし、痛覚過敏のため、最近まで NGF を使用した臨床試験はあまり成功していませんでした。 最近の研究では、遺伝子治療、NGF 投与の経鼻および眼経路が効果的であり、侵害受容性の副作用がはるかに少ないことが示されています。 さらに、NGF の化学修飾が痛みを軽減するという最近の発見は、NGF 療法の新しい方向性と考えられています。 脳のコリン作動性ニューロンにおけるアデノ随伴ウイルス媒介性 NGF 発現の有益な効果を評価する第 II 相臨床試験が、このプロジェクトの共同研究者である Jacobo Mintzer 博士を含む MUSC で進行中です。

NGF は神経支配ニューロンによって標的臓器から取り込まれ、逆行性軸索輸送によって軸索体に輸送されます。 研究者は、量子ドット標識 NGF を使用して、各 NGF 二量体が逆行輸送中に個々のエンドソームにパッケージ化されることを示しました。 末梢交感神経ニューロンと感覚ニューロン、および基底前脳コリン作動性ニューロンの生存、分化、および維持のための NGF シグナルの逆行性軸索輸送。 ボツリヌス毒素は逆行性経路をたどって中枢ニューロンに到達します。 さらに、ボツリヌス神経毒 A および E が、運動ニューロンを介した逆行性長距離輸送を介して神経系の遠位部位に到達することが最近確認され、このメカニズムが他の神経栄養因子の拡散にも共通している可能性があることが示唆されました。 これは、NGF の鼻腔内適用が NGF 療法に有効であると考えられる理由を説明するかもしれません。 さらに、胃腸経路をバイパスする舌下吸収経路は、ニトログリセリンおよび他の向精神薬の適用に使用されます。 したがって、唾液腺によって生成された NGF が、1) 細胞体への逆行性軸索輸送および中枢ニューロンに到達するためのトランスサイトーシスのための神経支配感覚ニューロンおよび運動ニューロン、および 2) 血流への舌下吸収経路によって取り込まれるという理論的根拠。他の遠位の標的臓器に到達することは、神経調節物質について確立された生産および輸送メカニズムの理論的枠組みの範囲内です。 この提案は、非侵襲的な方法で NGF を刺激する初めての試みであることをここで強調しておきます。

唱えることと歌うことは、人類の歴史における 2 つの古代の文化的慣行です。 最近の証拠は、これら 2 つの実践が呼吸を調節できることを示唆しています。 音のシンボルである Om (図 2) は、幸せな生活を送るための 1 文字の鍵と呼ばれています。 Om は、東洋の宗教全体でいくつかのチャンティングでよく知られている接頭辞です。 オームを唱えることは、身体的および感情的な幸福に関連していると考えられています。 Om を唱えると、皮膚の末梢血管抵抗が増加します。これは、生理学的にリラックスしている場合でも、精神的な覚醒が高まっていることを示しています。 アルツハイマー患者の約 40% では、中潜時聴覚誘発電位 (MLAEP) が欠けています。 Om を詠唱すると、詠唱後に健常者の MLAEP が改善されることが示されており、AD 対象者でも同様の効果が観察される可能性があることが示唆されています。 迷走神経刺激 (VNS) は認知機能を強化するため、AD 被験者に有益でした。 VNS の電気パルスは、大脳辺縁系の脳領域の非活性化を示しました。 オームの詠唱はまた、辺縁脳領域、扁桃体、海馬、海馬傍回、島、眼窩前頭および前帯状皮質および視床の同様の不活性化を引き起こした. Omを唱えることの神経生理学的効果は、迷走神経の耳介枝を介して媒介される可能性があります。 しかし、NGF のような神経栄養因子に関して、Om チャンティングの後に特定の分子変化が起こるかどうかは理解されていません。

呼吸運動 呼吸運動は、呼吸を調節する積極的な方法です。 一般的な呼吸の頻度は、正常な成人で 1 分間に 15 回です。 この周波数は、年齢や生理的状態によって変化します。 心不全の被験者では、ベルナルディらは、呼吸を遅くすることが有益であることを示しました. ヨガ、詠唱、呼吸運動などの運動は、呼吸と認知機能を調節します。 呼吸運動の利点に言及している古文書の 1 つは、健康と長寿の実践で知られているタミルの賢者 Thirumoolar によって書かれた Thirumanthiram です。 呼吸運動は、虚血プレコンディショニングの手段として、酸素化と非酸素化状態のサイクルを生み出すと考えられています。 遠隔虚血プレコンディショニング、すなわち、遠隔臓器に短期間の虚血を誘発することは、その後の虚血性傷害からの保護を提供します。 息止めは、迷走神経の緊張を高め、副交感神経の優位性を高め、交感神経の放電を減少させます。 調整された呼吸は、腹式/横隔膜式呼吸の優位性につながります。 したがって、呼吸運動は、ニューロンの虚血性プレコンディショニングを誘発する潜在的な方法である可能性があります。 虚血プレコンディショニングは、細胞生存シグナル伝達を生成することにより、将来の主要な虚血イベントを回避するのに有益であることが脳と心臓で知られています。 興味深いことに、NGF は細胞生存シグナル伝達分子です。 したがって、呼吸運動は、NGF の作用を介して中枢神経系細胞および末梢神経系細胞の細胞生存を誘導すると考えられます。

バイオマーカーとしての唾液 正常な人間は、1 日あたり約 0.75 ～ 1.5 L の唾液を生成します。 唾液には、ヒトおよび口腔微生物由来のタンパク質、ペプチド、mRNA、DNA、および miRNA を含む多数の生物学的に活性な分子が含まれています。 唾液分泌は、消化器系、神経系、免疫系、呼吸器系を調節します。 たとえば、1) 神経成長因子 (NGF)、サブスタンス P、およびカルシトニン遺伝子関連ペプチド (CGRP) が慢性片頭痛に反応して唾液中に分泌され、2) 強力な抗侵害受容剤であるオピオルフィンが唾液中に発現します。 唾液のプロテオミクスおよび mRNA のプロファイリングにより、対照群とがん患者の間の有意差が特定されました。 これらの研究は、唾液が AD を含む多くの病的状態の診断および予後におけるバイオマーカーの供給源として機能することを示しています。

重要性 AD などの神経変性疾患は、世界的な主要な医療問題となっています。 非薬理学的および非侵襲的な慣行は、正常および病理学的設定で神経機能を変化させる可能性があります。 神経栄養因子の唾液分泌は、唾液が神経栄養因子の潜在的な供給源およびバイオマーカーである可能性があることを示しています。 したがって、唾液 NGF 推定は、AD の診断と予後のためのツールとなる可能性があります。 古代タミル文化は、健康な心理的および生理学的状態を維持するための慣習を守ってきました。 詠唱と呼吸運動は、唾液分泌を促進することが知られています。 しかし、そのような慣行が唾液中の神経学的因子の発現を誘発するかどうかは完全には理解されていません. 私たちは、正常な人間の被験者の詠唱と呼吸運動に反応して、唾液中の NGF を定量化することを目指しています。 これにより、NGF の唾液分泌と神経系への影響に対する舌の触覚と呼吸信号の間のこれまで報告されていない関係が確立されます。 私たちのプロジェクトは、基礎、運動中、および運動後の唾液中の候補神経栄養因子NGFを定量化します。 今後の研究では、プロテオミクス、ペプチド、ゲノムのアプローチを使用して、これらの運動によって唾液で調節される他の神経栄養因子を特定します。 私たちの調査結果は、アルツハイマー病やその他の神経変性疾患を持つ/傾向のある個人の治療とケアに新しいパラダイムを導入します。

臨床的および翻訳的影響: AD、加齢およびその他の神経変性疾患が神経栄養因子産生の低下と関連しているという事実を考えると (例: NGF）、および NGF が臨床試験で薬物として積極的に追求されていることから、NGF は単純で非侵襲的な民族的慣行によってその場で刺激できるという我々の発見は、強力な臨床応用をもたらすでしょう。 ゲノムおよびプロテオーム アプローチを使用した今後の研究では、AD やその他の神経変性疾患を治療するための薬物標的となる可能性のある、唾液中の追加の神経栄養因子が特定されるでしょう。

C. 予備調査 なし。 D. 研究計画と方法 ヒト被験者

18歳以上の合計20人のボランティア（男性または女性）が研究に含まれます。 除外条件のリストは次のとおりです。

• 呼吸の問題（鼻孔から呼吸できない、慢性気管支炎、肺気腫、喘息）
• 詠唱を妨げる発話の問題
• 運動の指示を聞いて従うことができない
• 副鼻腔のうっ血
• シェーグレン症候群
• 薬やその他の状態による慢性的なドライマウス
• 抗コリン薬の使用 研究を完全に説明した後、各被験者からインフォームドコンセントが得られます。

被験者の募集 IRB の承認を得たら、MUSC エレベーターと近くのヨガ センターに広告を掲載して、この研究に必要な 20 人の被験者を募集します。 関心のある参加者は、指定された電話番号で PI に連絡します。 被験者の適格性は、アンケートに記載された質問に基づいて PI によって評価されます。 PI と参加者は、予約時間に同意します。 参加者は、Strom Thurmond Building (STB、Room 222) の PI の研究室に来ます。 この会議室は主任研究者の研究室と同じ階にあります。 プロトコル中に他のラボ担当者による干渉がなく、静かな雰囲気のため、この部屋を選びました。 この部屋は Gazes Cardiac Research Institute Lab Manager によって予約されており、PI は自由に利用できます。 到着後、PI は被験者に研究について説明し、同意書を使用して同意を得ます。 また、PI は同意書に署名して日付を記入し、コピーを参加者に渡します。 その後、被験者は質問票に記入して適格性を確認します。

登録され、同意された被験者は、2 つの条件 (「詠唱/呼吸」(CB) アームと「コントロール」アーム) のいずれかに無作為に割り付けられます。 無作為化は、生物統計学者と協力して実施され、2 つの実験グループ (CB 対 コントロール) で均等な性別分布を確保するために、層化された方法 (つまり、性別による) で行われます。 生物統計学者は、研究識別番号とランダムなグループ割り当て（つまり、 CB 対 コントロール)。 各封筒は、研究の適格性が確立され、同意が得られた後にのみ開封されます。

運動とサンプル収集の前に、PI は各被験者に詠唱と呼吸運動の実行方法を教えます。 各被験者は、サンプル収集を容易にするため、および研究者以外の個人の存在下で被験者の神経刺激に生じる可能性のある変動を避けるために、個別にテストします。

チャンティング、呼吸エクササイズ、標本収集 対象者は、チャンティングと呼吸のエクササイズを紹介されます。 チャンティング/ヨガ/呼吸エクササイズの実践者として、PI はこのトレーニングを提供します。習得に 5 分以上かかることはありません。 全体の唾液サンプルを収集するための計画は、図 3に示されています。被験者が着席している間、唾液サンプルは、プロトコル (時間 0) の開始時に 1 回収集されます。 唾液は自然に口腔内に蓄積され、参加者はそれを蓋付きの検体チューブ (容量 5 mL) に排出します。

詠唱オーム (C):

次に、対象者は次のように Om を唱えます。

1. 鼻孔から鋭く深く吸い込む
2. Omを唱えながら、口からゆっくりと息を吐きます。 このステップで、被験者はゆっくりと完全に息を吐き出します。

これらの 2 つの手順は、目を閉じて 10 分間連続して繰り返されます。

呼吸運動 (BE):

詠唱に続いて、被験者はティルマンティラムに基づいてPIの指示に従って、次のように呼吸運動を行います。

1. 2 つの鼻孔のどちらが空気の自由な流れを示すかを確認します。 説明のために、自由に空気が流れる鼻孔を鼻孔 1、もう一方の鼻孔を鼻孔 2 とします。
2. 鼻孔 2 を閉じて、鼻孔 1 から鋭い深呼吸を吸い込み、両方の鼻孔を閉じて、吸い込んだ空気が逃げないようにします。 空気も口から逃げてはいけません。 この吸入ステップには約 4 秒かかります。
3. この位置で約16秒間息を止めます。
4. 鼻孔 2 を開き、約 8 秒間息を吐き出します。 完全な呼気が必要です。 被験者が息を吐き出すと、腹部がゆっくりと内側に曲がります。 これは正常であり、奨励されています。 鼻孔 1 または口から空気が漏れてはなりません。
5. ステップ a) に進みます。 運動中に口腔内に唾液が溜まると、被験者は呼気の最後に唾液を飲み込むことができます（ステップ d）。 被験者は 10 分間の呼吸運動を行います。 唾液サンプルは、BE-1、BE-2 と表示されたチューブに 5 分間と 10 分間の呼吸運動で収集されます。 したがって、各個人は次の 5 つの唾液サンプルを提供します: + (時間 0)、オーム チャンティング (C-1 および C2)、および呼吸運動 (BE-1 および BE-2)。

対照群 対照群の場合、被験者は CB 群と同じ時間静かに座ります。 唾液サンプルは、CB グループと同じ時点 (5 分間隔で 20 分間) に収集されます。

プロトコル全体のおおよその合計時間は次のようになります。

イントロダクションとアンケート - 10 分 チャンティング、呼吸運動 (CB グループ) または静かに座る (コントロール グループ) の指導と唾液サンプルの収集 - 10 分 (CB グループ) または 5 分 (コントロール グループ) 基礎サンプルの収集 - 1 分 Om チャンティング - 10 分 呼吸法 - 10 分 被験者によるその他の質問 - 2 ～ 3 分 被験者の合計予約時間 = 約 45 分 (CB グループ) 40 分 (コントロール グループ)提供されます。

サンプルの処理 採取した唾液サンプルを氷上に置きます。 無菌技術を使用して、各サンプルの量を測定しながら唾液を遠心管に移します。 実験の各ステップで各サンプルから収集されたサンプルの数は異なる場合があります。 サンプルをプールせずに、個々のチューブからのサンプルを個別に処理します。 通常の安静時、詠唱中、呼吸運動中の唾液の総量を計算します。 分析まで-80℃でサンプルを保管してください。 サンプルは、データ分析後に破棄されます。

酵素免疫測定法 メーカーの説明書 (Promega) に従って市販のキットを使用した酵素免疫測定法により、各サンプルの NGF のレベルを定量化します。 ELISA 実験に必要なすべての試薬がキットに含まれています。 追加の試薬がある場合は、ELISA リーダーは STB Room 511 の PI が利用できます。

データ管理 PI によって参加者から収集されたすべての研究データは、プロジェクトの生物統計学者の支援を受けて開発された REDCap データベースに入力されます。 REDCap (Research Electronic Data Capture) は、MUSC の研究者が利用できる研究および臨床試験データを電子的に収集および管理するためのソフトウェア ツールセットおよびワークフロー方法論です。 反復的な開発とテストのプロセスにより、データ入力、編集チェック、最終的な統計分析を容易にする個々の研究のためのよく計画されたデータ収集戦略が生まれます。 基盤となるデータベースは MUSC データ センターでホストされており、システムはログインと SSL (Secure Sockets Layer) 暗号化によって保護されています。

統計分析 統計分析は、この研究の開発においてPIと協力した生物統計学者の指導の下で行われます。 最初に、記述統計を使用して、人口統計学、関連する臨床的特徴、およびベースライン時および経時的な NGF 測定に関して研究参加者を特徴付けます。 人口統計およびその他のベースライン変数のグループの違いは、必要に応じて、t 検定、カイ 2 乗検定、およびフィッシャーの正確確率検定によって調べられます。 この研究は、唾液中の NGF を刺激するためのこれらのエクササイズ (詠唱および/または呼吸と安静時のコントロール) の有効性の予備的証拠を得ることを目的としています。そのため、正式な仮説検定は実施されません。 代わりに、一般線形混合モデル (GLMM) を使用して、NGF レベルに関して時間の経過に伴うグループ差の推定値 (およびそれぞれの 95% 信頼区間) を取得します。 GLMM は、被験者間および被験者内の変動性を含む分析に理想的であり、この提案された研究に使用されるような反復測定研究デザインに特に役立ちます。 年齢は NGF に影響を与えると考えられているため、年齢はすべてのモデルに共変量として含まれます。 時間の線形、二次、および三次効果が考慮されます。 さまざまなタイプの誤差共分散構造が調べられ、赤池情報量基準の値を使用して、最も適切に適合する GLMM が選択されます。 GLMM を使用すると、両方の実験条件で経時的に NGF 測定値の典型的な軌跡を特徴付けることができ、また、CB グループ内で詠唱と呼吸の練習を比較する機会が得られます。 このタイプの統計モデリングの結果は、(外部資金による) 将来の大規模で決定的な研究の計画に役立ちます。

サンプルサイズの正当化 正式な仮説検定は実施されないため、統計的検出力はこの提案には関係ありません。したがって、サンプルサイズの正当化は、推定プロセスの精度と、この研究の被験者の登録、観察、測定、および可能な限り最も効率的な方法での臨床検査の実施に関連する学習経験に基づいています。 各実験グループに n=10 の被験者 (合計 n=20 の被験者) がいると、各グループの経時的な NGF 測定値の予備的な推定を行うことができます。 グループあたり n=10 の被験者の場合、グループ平均推定値の周りの 95% 信頼区間はどちらの方向にも ~0.6 標準偏差広がり、平均グループ差推定値の周りの 95% 信頼区間はどちらの方向にも ~0.9 標準偏差広がります。 グループあたり n = 10 の場合、このタイプの補完代替医療研究で無作為化される被験者の意欲と、詠唱と呼吸の練習介入の提供に関連する最良の技術について、より深い理解を得ることができます。

E. ヒト被験者の保護

1. 被験者へのリスク この研究には、18 歳以上の年齢層の男性と女性の両方で 20 人の被験者が参加します。 このプロトコルは、個々の参加者に対する 1 回の訪問、1 対 1 のセッションで構成されます。 これらの演習は、参加者に身体的、心理的、社会的リスクをもたらすものではありません。 アンケートは被験者の健康情報を収集するため、守秘義務の違反は潜在的なリスクの 1 つになる可能性があります。 参加者は、他の個人の前で唾を吐いたりよだれを垂らしたりするのに少し不快に感じるかもしれません. 参加者は、事前にエクササイズを知らなかったり、エクササイズの指示に完全に従うことができないと感じたりする可能性があります。

   リスクに対する保護 インストラクターは、被験者が安心して快適に過ごせるように努めます。 調査で収集されたすべての情報は、機密性を保持して取り扱われ、上記のように安全なサーバーに保存されます。 本研究で作成された書類には、個人情報が含まれている可能性があります。 これらの文書は、MUSC の STB の 625 号室にある PI の施錠されたキャビネットに保管されます。 参加者は、すべての文書、データ、および唾液サンプルの識別番号によって識別されます。 インフォームド コンセントは、参加者の ID 番号と名前の間のリンクです。 収集された唾液サンプルは、STB ルーム 213 のロック付きの-80 度の冷凍庫で保護され、データ分析の直後に破棄されます。 呼吸法と詠唱は穏やかな運動形式であり、参加者に健康上のリスクをもたらすことはありません. 研究参加者は、別の研究のために連絡を受けることはありません。

2. 対象者の潜在的な健康上の利点 特にヨガの呼吸と一般的なヨガは、健康的な生活を送るための優れたエクササイズです。 いくつかの研究は、ヨガの呼吸がストレスを軽減し、複数の患者グループや健康な個人の生活の質を改善することを示しています. 研究の終わりに、詠唱/呼吸運動グループの被験者は、神経栄養効果のために身体的および心理的に気分が良くなる可能性があります. これらの被験者は、長期的には継続的な練習が彼らに利益をもたらす可能性があるため、呼吸を調整するための新しい技術を別の文化から学ぶことになります（異文化体験）。