欧登塞儿童队列 1 中的维生素 D 和血管生成标志物 (VITAM)

总体：欧登塞儿童队列研究 (OCC) 是一项基于人群的队列研究，包括 2010 年 1 月 1 日至 2012 年 12 月 31 日期间招募的孕妇。 在此期间，欧登塞市所有怀孕的妇女都有资格参加，并直接向 6,707 名妇女提供了招聘材料。

该研究符合赫尔辛基宣言，并得到南丹麦地区科学伦理委员会的批准，编号。 S-20090130。 所有参与者都知情同意。 截至 2012 年 12 月 31 日，在 6,707 名孕妇的人口基数中，有 2,874 名 (42.9%) 参加了 OCC。 孩子们将被跟踪到 18 岁。

血清样本在妊娠早期（GA 2-25 周）、妊娠晚期（GA 26-30 周）、出生时的母体血清和脐带血以及 3 个月、1 岁、3 岁时的儿童的一般检查中采集年。

问卷由家庭在妊娠早期、妊娠晚期、出生后以及儿童临床检查时完成。

有关健康变量的登记数据可从丹麦登记处进一步获得。

目的：维生素 D 和血管生成标志物研究 1 检查妊娠期血清生物标志物 25(OH)D 与可溶性 Fms 样激酶 1 (sFlt-1) 和胎盘生长因子 (PlGF) 之间的关系以及作为不良结局的流产风险在怀孕初期。

方法：

• 25(OH)D 分析：血清储存在 -80 摄氏度直至分析，分析通过液相色谱质谱法 (LC-MS/MS) 进行。 将标记为 25(OH) 维生素 D3 的三重氘添加到血清样品中作为内标，并用甲醇中的 ZnSO4 脱蛋白，以 2750 g 离心 10 分钟，然后将 100 μl 注射到 LC-MS 上的 TurboFlow 柱（Thermo Scientific）上/多发性硬化症。 LC-MS/MS 由连接到 Thermo Scientific Vantage TSQ 的 Thermo Scientific TLX1 系统组成。 25(OH)D2 和 25(OH)D3 在 Thermo Scientific Cyclone P 50 x 1.0 mm 柱上浓缩并在分析柱 Phenomenex Gemini C18 50 x 3.0 mm 上反冲，并通过梯度从分析柱洗脱。 流动相是 A：水中的 10 mM NH4Ac 和 B：甲醇中的 10 mM NH4Ac。 人血清中加入适量的 25(OH)D2 和 25(OH)D3，以生成六点校准曲线（加权 1/x2）和 QC 样品的 3 个水平（低、中、高）。 该方法根据 NIST 标准 972.25 进行校准 D3 的 C3 差向异构体与 D3 一起检测到，两者无法区分。 D2 和 D3 的最低可检测浓度均为 0.15 nM。 仅当高于 6.5 nM 时才考虑 D2 和 D3 的值。
• BRAHMS sFlt-1 和 PIGF KRYPTOR 测定的测量是根据制造商的说明在全自动 KRYPTOR compact Plus 系统（KRYPTOR PlGF 和 KRYPTOR sFlt-1；Thermo Fisher Scientific）上进行的。 BRAHMS sFlt-1 和 PlGF KRYPTOR 测定是基于 Trace 技术的同质夹心免疫测定 24。 测定的总持续时间为 9 分钟 (sFlt-1) 和 29 分钟 (PlGF)，样品体积分别为 9 μl 和 70 μl。 测定用重组人 sFlt-1 和 PIGF 校准，并针对 Quantikine PIGF ELISA（R&D Systems Europe Ltd，Abingdon，UK）和 sFlt-1 Elecsys 测定（Elecsys，Penzberg，Germany）进行标准化。 根据制造商的使用说明，KRYPTOR sFlt-1 测定涵盖了 22-90,000 pg/ml 的测量范围。 检测限为 22 pg/ml，量化限（功能灵敏度）为 29 pg/ml。 sFlt-1 浓度为 1540 pg/ml 时的批内和批间变异分别为 0.3% 和 0.8%；在 2988 pg/ml 时 0.5% 和 1.1%；在 9666 pg/ml 时分别为 0.5% 和 1.0%。 KRYPTOR PlGF 测定的测量范围为 3.6-7.000 皮克/毫升。 检测限为 3.6 pg/ml，定量限为 6.9 pg/ml。 PlGF 浓度为 35 pg/ml 时的批内和批间变异分别为 4.6% 和 7.3%；在 103 pg/ml 时分别为 2.1% 和 3.1%，在 430 pg/ml 时分别为 0.9% 和 2.3%。
• Elecsys sFlt-1 和 PIGF 测定的测量是根据制造商的说明在全自动 Elecsys 系统（Elecsys，Penzberg，德国）上进行的。 Elecsys 检测是基于电化学发光技术的夹心免疫检测。 测定的总持续时间为 18 分钟，sFlt-1 的样品体积为 20 μl，PIGF 的样品体积为 50 μl。 测定用重组人 PIGF 和 sFlt-1 校准，并针对 Quantikine PIGF 和血管内皮生长因子-R1 ELISA（R&D Systems，Minneapolis，MN）进行标准化。 根据制造商的使用说明，Elecsys sFlt-1 检测的测量范围为 10-85,000 pg/ml，Elecsys PIGF 检测的测量范围为 3-10,000 pg/ml。 检测限为 10 pg/ml (sFlt-1) 和 3 pg/ml (PIGF)。 sFlt-1 的量化限度为 15 pg/ml，PIGF 的量化限度为 10 pg/ml。

维生素 D 和血管生成标志物研究 1：

妊娠早期的维生素 D 和血管生成标志物。 流行病学和早孕流产的关联

• 在妊娠早期收集的 1728 份血清样本中，通过 LC-MS/MS 研究了血清 25(OH)D 水平，并通过免疫测定法测定了 1720 份样本中的 sFlt-1 和 PlGF 水平。 利用调查问卷和病历资料，采用多元线性回归和逻辑回归确定影响早孕25(OH)D水平和sFlt/PlGF的因素。
• 在胎龄 22+0 周之前收集的 1675 份血清样本中，进行了分析以评估 sFlt-1 和 PlGF 水平作为流产生物标志物的预测特性 (n=59)。
• 在胎龄 22+0 周前收集的 1684 份血清样本中，比较了随后发生自然流产的妇女 (n=59) 和其他人群的 25(OH)D 水平，并针对选定的协变量进行了校正。