Vitamina D y marcadores angiogénicos en la cohorte infantil 1 de Odense (VITAM)

En general: El Estudio de Cohorte Infantil de Odense (OCC) es un estudio de cohorte basado en la población, que comprende mujeres embarazadas reclutadas entre el 1 de enero de 2010 y el 31 de diciembre de 2012. Todas las mujeres que estaban embarazadas en el municipio de Odense durante este tiempo fueron elegibles para participar, y se acercó directamente a 6.707 mujeres con material de reclutamiento.

El estudio cumplió con la declaración de Helsinki y fue aprobado por el Comité Ético Científico Regional para el Sur de Dinamarca, no. S-20090130. Todos los participantes dieron su consentimiento informado. De una base poblacional de 6.707 gestantes, 2.874 (42,9%) inscritas en el CCO al 31 de diciembre de 2012. Los niños serán seguidos hasta los 18 años de edad.

Se tomaron muestras de suero al inicio del embarazo (EG 2-25 semanas), al final del embarazo (EG 26-30 semanas), suero materno y sangre de cordón al nacer, y de los niños junto con exámenes generales a las edades de 3 meses, 1 año, 3 años.

Los cuestionarios fueron completados por las familias al principio del embarazo, al final del embarazo, después del nacimiento y en el momento del examen clínico de los niños.

Los datos de registro sobre variables de salud también estaban disponibles en los registros daneses.

Objetivo: El Estudio 1 de vitamina D y marcadores angiogénicos examina la relación entre los biomarcadores séricos 25(OH)D y la quinasa 1 similar a Fms soluble (sFlt-1) y el factor de crecimiento placentario (PlGF) en el embarazo y el riesgo de aborto espontáneo como resultado adverso en el embarazo temprano.

Método:

• Análisis de 25(OH)D: El suero se almacenó a -80º Celsius hasta el análisis, que se realizó mediante espectrometría de masas por cromatografía líquida (LC-MS/MS). Se añadió triple deuterio marcado con 25(OH)vitamina D3 a las muestras de suero como estándar interno y se desproteinizaron con ZnSO4 en metanol, se centrifugaron a 2750 g durante 10 minutos y se inyectaron 100 μl en la columna TurboFlow (Thermo Scientific) en el LC-MS /EM. El LC-MS/MS constaba de un sistema Thermo Scientific TLX1 conectado a un Thermo Scientific Vantage TSQ. 25(OH)D2 y 25(OH)D3 se concentraron en una columna Thermo Scientific Cyclone P 50 x 1,0 mm y se lavaron a contracorriente en la columna analítica Phenomenex Gemini C18 50 x 3,0 mm y se eluyeron de la columna analítica mediante un gradiente. Las fases móviles fueron A: NH4Ac 10 mM en agua y B: NH4Ac 10 mM en metanol. Se añadió suero humano con cantidades apropiadas de 25(OH)D2 y 25(OH)D3 para producir curvas de calibración de seis puntos (pesadas 1/x2) y 3 niveles de muestras de control de calidad (bajo, medio, alto). El método fue calibrado contra el estándar NIST 972.25 El epímero C3 de D3 se detectó junto con D3 y los dos no se distinguían entre sí. Las concentraciones detectables más bajas fueron 0,15 nM tanto para D2 como para D3. Los valores de D2 y D3 solo se consideraron si estaban por encima de 6,5 nM.
• Las mediciones para los ensayos BRAHMS sFlt-1 y PIGF KRYPTOR se realizaron en el sistema KRYPTOR compact Plus completamente automatizado (KRYPTOR PlGF y KRYPTOR sFlt-1; Thermo Fisher Scientific) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los ensayos BRAHMS sFlt-1 y PlGF KRYPTOR son inmunoensayos tipo sándwich homogéneos basados ​​en la tecnología Trace24. La duración total de los ensayos es de 9 minutos (sFlt-1) y 29 minutos (PlGF) y el volumen de muestra es de 9 µl y 70 µl, respectivamente. Los ensayos se calibran con sFlt-1 humano recombinante y PIGF y se estandarizan frente a Quantikine PIGF ELISA (R&D Systems Europe Ltd, Abingdon, Reino Unido) y frente al ensayo sFlt-1 Elecsys (Elecsys, Penzberg, Alemania). De acuerdo con las instrucciones de uso del fabricante, el ensayo KRYPTOR sFlt-1 cubrió un rango de medición de 22 a 90 000 pg/ml. El límite de detección es de 22 pg/ml y el límite de cuantificación (sensibilidad funcional) es de 29 pg/ml. Las variaciones intraensayo e interensayo a una concentración de sFlt-1 de 1540 pg/ml son 0,3% y 0,8%, respectivamente; a 2988 pg/ml 0,5% y 1,1%; ya 9666 pg/ml 0,5% y 1,0%, respectivamente. El ensayo KRYPTOR PlGF cubre un rango de medición de 3.6-7.000 pg/ml. El límite de detección es de 3,6 pg/ml y el límite de cuantificación es de 6,9 ​​pg/ml. Las variaciones intraensayo e interensayo a una concentración de PlGF de 35 pg/ml son del 4,6% y 7,3%, respectivamente; a 103 pg/ml 2,1% y 3,1%, ya 430 pg/ml 0,9% y 2,3%, respectivamente.
• Las mediciones para los ensayos Elecsys sFlt-1 y PIGF se realizaron en el sistema Elecsys completamente automatizado (Elecsys, Penzberg, Alemania) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los ensayos Elecsys son inmunoensayos sándwich basados ​​en la tecnología de electroquimioluminiscencia. La duración total de los ensayos es de 18 minutos y el volumen de muestra es de 20 µl para sFlt-1 y 50 µl para PIGF. Los ensayos se calibran con PIGF humano recombinante y sFlt-1 y se estandarizan contra Quantikine PIGF y factor de crecimiento endotelial vascular-R1 ELISA (R&D Systems, Minneapolis, MN). De acuerdo con las instrucciones de uso del fabricante, el ensayo Elecsys sFlt-1 cubre un rango de medición de 10 a 85 000 pg/ml, el ensayo Elecsys PIGF de 3 a 10 000 pg/ml. El límite de detección es de 10 pg/ml (sFlt-1) y 3 pg/ml (PIGF). El límite de cuantificación es de 15 pg/ml para sFlt-1 y de 10 pg/ml para PIGF.

El estudio 1 de vitamina D y marcadores angiogénicos:

Vitamina D y marcadores angiogénicos en el embarazo temprano. Epidemiología y asociaciones con el aborto espontáneo temprano en el embarazo

• En 1728 muestras de suero recolectadas al principio del embarazo, los niveles de 25(OH)D en suero se investigaron mediante LC-MS/MS y los niveles de sFlt-1 y PlGF se determinaron mediante inmunoensayos en 1720 muestras. Se utilizó la información del cuestionario y del expediente médico para determinar los factores que influyeron en los niveles de 25(OH)D y sFlt/PlGF en el embarazo temprano mediante regresión lineal múltiple y regresión logística.
• En 1675 muestras de suero recolectadas antes de la edad gestacional de 22+0 semanas, se realizó un análisis para evaluar las propiedades predictivas de los niveles de sFlt-1 y PlGF como biomarcadores de aborto espontáneo (n=59).
• En 1684 muestras de suero recolectadas antes de las 22+0 semanas de edad gestacional, se compararon los niveles de 25(OH)D entre mujeres que posteriormente sufrieron abortos espontáneos (n=59) y el resto de la población, corregidos por covariables seleccionadas.