Vitamine D et marqueurs angiogéniques dans la cohorte d'enfants d'Odense 1 (VITAM)

Dans l'ensemble : l'étude de cohorte d'enfants d'Odense (OCC) est une étude de cohorte basée sur la population, comprenant des femmes enceintes recrutées entre le 1er janvier 2010 et le 31 décembre 2012. Toutes les femmes qui étaient enceintes dans la municipalité d'Odense pendant cette période étaient éligibles pour participer, et 6 707 femmes ont été approchées directement avec du matériel de recrutement.

L'étude était conforme à la déclaration d'Helsinki et a été approuvée par le Comité régional d'éthique scientifique pour le sud du Danemark, no. S-20090130. Tous les participants ont donné leur consentement éclairé. Sur une population de base de 6 707 femmes enceintes, 2 874 (42,9 %) se sont inscrites à l'OCC jusqu'au 31 décembre 2012. Les enfants seront suivis jusqu'à l'âge de 18 ans.

Des échantillons de sérum ont été prélevés en début de grossesse (GA 2-25 semaines), en fin de grossesse (GA 26-30 semaines), de sérum maternel et de sang de cordon à la naissance, et chez les enfants avec des examens généraux à 3 mois, 1 an, 3 années.

Des questionnaires ont été remplis par les familles en début de grossesse, en fin de grossesse, après l'accouchement et lors de l'examen clinique des enfants.

Les données des registres sur les variables de santé étaient en outre disponibles auprès des registres danois.

Objectif : L'étude 1 sur la vitamine D et les marqueurs angiogéniques examine la relation entre les biomarqueurs sériques 25(OH)D et la kinase 1 de type Fms soluble (sFlt-1) et le facteur de croissance placentaire (PlGF) pendant la grossesse et le risque de fausse couche comme résultat indésirable en début de grossesse.

Méthode:

• Analyse 25(OH)D : Le sérum a été stocké à -80° Celsius jusqu'à l'analyse, qui a été réalisée par spectrométrie de masse par chromatographie liquide (LC-MS/MS). De la 25(OH)vitamine D3 triplement marquée au deutérium a été ajoutée à des échantillons de sérum comme étalon interne et déprotéinée avec du ZnSO4 dans du méthanol, centrifugée à 2750 g pendant 10 minutes, et 100 μl ont été injectés sur la colonne TurboFlow (Thermo Scientific) sur le LC-MS /SP. Le LC-MS/MS consistait en un système Thermo Scientific TLX1 connecté à un Thermo Scientific Vantage TSQ. La 25(OH)D2 et la 25(OH)D3 ont été concentrées sur une colonne Thermo Scientific Cyclone P 50 x 1,0 mm et rincées à contre-courant sur la colonne analytique, Phenomenex Gemini C18 50 x 3,0 mm et éluées de la colonne analytique par un gradient. Les phases mobiles étaient A : NH4Ac 10 mM dans l'eau et B : NH4Ac 10 mM dans le méthanol. Le sérum humain a été dopé avec des quantités appropriées de 25(OH)D2 et 25(OH)D3 afin de produire des courbes d'étalonnage à six points (pesées 1/x2) et 3 niveaux d'échantillons QC (faible, moyen, élevé). La méthode a été calibrée par rapport à la norme NIST 972.25 L'épimère C3 de D3 a été détecté avec D3 et les deux ne se distinguaient pas l'un de l'autre. Les concentrations détectables les plus basses étaient de 0,15 nM pour D2 et D3. Les valeurs de D2 et D3 n'ont été prises en compte que si elles étaient supérieures à 6,5 nM.
• Les mesures pour les tests BRAHMS sFlt-1 et PIGF KRYPTOR ont été effectuées sur le système entièrement automatisé KRYPTOR compact Plus (KRYPTOR PlGF et KRYPTOR sFlt-1 ; Thermo Fisher Scientific) conformément aux instructions du fabricant. Les dosages BRAHMS sFlt-1 et PlGF KRYPTOR sont des dosages immunologiques sandwich homogènes basés sur la technologie Trace24. La durée totale des tests est de 9 minutes (sFlt-1) et 29 minutes (PlGF) et le volume d'échantillon est de 9 µl et 70 µl, respectivement. Les tests sont calibrés avec sFlt-1 et PIGF humains recombinants et standardisés par rapport au Quantikine PIGF ELISA (R&D Systems Europe Ltd, Abingdon, Royaume-Uni) et par rapport au test sFlt-1 Elecsys (Elecsys, Penzberg, Allemagne). Selon les instructions d'utilisation du fabricant, le test KRYPTOR sFlt-1 couvrait une plage de mesure de 22 à 90 000 pg/ml. La limite de détection est de 22 pg/ml et la limite de quantification (sensibilité fonctionnelle) est de 29 pg/ml. Les variations intra- et inter-essais à une concentration de sFlt-1 de 1540 pg/ml sont respectivement de 0,3 % et 0,8 % ; à 2988 pg/ml 0,5 % et 1,1 %; et à 9666 pg/ml 0,5 % et 1,0 %, respectivement. Le test KRYPTOR PlGF couvre une plage de mesure de 3,6 à 7 000 pg/ml. La limite de détection est de 3,6 pg/ml et la limite de quantification est de 6,9 ​​pg/ml. Les variations intra- et inter-essais à une concentration de PlGF de 35 pg/ml sont respectivement de 4,6% et 7,3% ; à 103 pg/ml 2,1 % et 3,1 %, et à 430 pg/ml 0,9 % et 2,3 %, respectivement.
• Les mesures pour les tests Elecsys sFlt-1 et PIGF ont été effectuées sur le système Elecsys entièrement automatisé (Elecsys, Penzberg, Allemagne) conformément aux instructions du fabricant. Les dosages Elecsys sont des dosages immunologiques en sandwich basés sur la technologie de l'électrochimiluminescence. La durée totale des essais est de 18 minutes et le volume d'échantillon est de 20 µl pour sFlt-1 et 50 µl pour PIGF. Les dosages sont calibrés avec le PIGF humain recombinant et le sFlt-1 et standardisés par rapport au PIGF Quantikine et au facteur de croissance endothélial vasculaire-R1 ELISA (R&D Systems, Minneapolis, MN). Selon les instructions d'utilisation du fabricant, le test Elecsys sFlt-1 couvre une plage de mesure de 10 à 85 000 pg/ml, le test Elecsys PIGF de 3 à 10 000 pg/ml. La limite de détection est de 10 pg/ml (sFlt-1) et 3 pg/ml (PIGF). La limite de quantification est de 15 pg/ml pour sFlt-1 et 10 pg/ml pour PIGF.

L'étude 1 sur la vitamine D et les marqueurs angiogéniques :

Vitamine D et marqueurs angiogéniques en début de grossesse. Épidémiologie et associations avec les fausses couches en début de grossesse

• Dans 1728 échantillons de sérum prélevés en début de grossesse, les niveaux de 25(OH)D sérique ont été étudiés par LC-MS/MS et les niveaux de sFlt-1 et de PlGF ont été déterminés par des dosages immunologiques dans 1720 échantillons. Les informations du questionnaire et du dossier médical ont été utilisées pour déterminer les facteurs influençant les niveaux de 25(OH)D et de sFlt/PlGF en début de grossesse par régression linéaire multiple et régression logistique.
• Dans 1675 échantillons de sérum prélevés avant l'âge gestationnel de 22+0 semaines, une analyse a été effectuée pour évaluer les propriétés prédictives des taux de sFlt-1 et de PlGF en tant que biomarqueurs de fausse couche (n = 59).
• Dans 1684 échantillons de sérum prélevés avant l'âge gestationnel de 22+0 semaines, les niveaux de 25(OH)D ont été comparés entre les femmes qui ont ensuite subi des avortements spontanés (n = 59) et le reste de la population, corrigés pour certaines covariables.