D-vitamin és angiogén markerek az Odense Child Cohort 1-ben (VITAM)

Összességében: Az Odense Child Cohort Study (OCC) egy populáció alapú kohorszvizsgálat, amely 2010. január 1. és 2012. december 31. között toborzott terhes nőket von be. Minden nő, aki ez idő alatt várandós volt Odense településen, részt vehetett a részvételen, és 6707 nőt közvetlenül megkerestek a toborzási anyagokkal.

A tanulmány megfelelt a helsinki nyilatkozatnak, és a Dél-Dániai Regionális Tudományos Etikai Bizottság 1. sz. S-20090130. Minden résztvevő tájékoztatáson alapuló beleegyezését adta. 2012. december 31-ig a 6707 terhes nőből álló lakosságból 2874 (42,9%) jelentkezett be az OCC-be. A gyerekeket 18 éves korukig követik.

A szérummintákat a terhesség korai szakaszában (GA 2-25 hét), késői terhességben (GA 26-30 hét), anyai szérum- és köldökzsinórvérben vettük születéskor, valamint a gyermekektől általános vizsgálatokkal 3 hónapos, 1 éves, 3 éves korban. évek.

A kérdőíveket a családok korai várandósságban, késői várandósságban, születés után, valamint a gyermekek klinikai vizsgálatakor töltötték ki.

Az egészségügyi változókra vonatkozó regiszteradatok a dán nyilvántartásokból is elérhetők voltak.

Célkitűzés: A D-vitamin és angiogén marker 1. vizsgálata a szérum biomarkerek 25(OH)D és az oldható Fms-szerű kináz 1 (sFlt-1) és a placenta növekedési faktor (PlGF) közötti kapcsolatot vizsgálja terhesség alatt, valamint a vetélés kockázatát, mint kedvezőtlen eredményt. a terhesség korai szakaszában.

Módszer:

• 25(OH)D analízis: A szérumot -80°C-on tároltuk az elemzésig, amelyet folyadékkromatográfiás tömegspektrometriával (LC-MS/MS) hajtottunk végre. A szérummintákhoz belső standardként 25(OH)-D3-vitaminnal jelölt hármas deutériumot adtunk, és metanolos ZnSO4-tal deproteinizáltuk, 2750 g-vel 10 percig centrifugáltuk, és 100 μl-t injektáltunk az LC-MS TurboFlow oszlopára (Thermo Scientific). /KISASSZONY. Az LC-MS/MS egy Thermo Scientific TLX1 rendszerből állt, amely egy Thermo Scientific Vantage TSQ-hoz volt csatlakoztatva. A 25(OH)D2-t és 25(OH)D3-at Thermo Scientific Cyclone P 50 x 1,0 mm-es oszlopon koncentráltuk, majd visszaöblítettük a Phenomenex Gemini C18 50 x 3,0 mm-es analitikai oszlopon, és gradienssel eluáltuk az analitikai oszlopról. A mobil fázisok a következők voltak: A: 10 mM NH4Ac vízben és B: 10 mM NH4Ac metanolban. A humán szérumot megfelelő mennyiségű 25(OH)D2-vel és 25(OH)D3-mal töltöttük fel, hogy hatpontos kalibrációs görbét (1/x2 súlyú) és 3 szintű minőségellenőrzési mintát (alacsony, közepes, magas). A módszert a NIST 972.25 szabvány szerint kalibrálták A D3 C3 epimerjét a D3-mal együtt detektáltuk, és a kettő nem volt megkülönböztethető egymástól. A legalacsonyabb kimutatható koncentráció 0,15 nM volt mind a D2, mind a D3 esetében. A D2 és D3 értékeket csak akkor vettük figyelembe, ha azok 6,5 nM felettiek.
• A BRAHMS sFlt-1 és PIGF KRYPTOR vizsgálatokhoz a méréseket a teljesen automatizált KRYPTOR compact Plus rendszeren (KRYPTOR PlGF és KRYPTOR sFlt-1; Thermo Fisher Scientific) végeztük a gyártó utasításai szerint. A BRAHMS sFlt-1 és PlGF KRYPTOR tesztek a Trace technológián alapuló homogén szendvics immunológiai vizsgálatok24. A vizsgálatok teljes időtartama 9 perc (sFlt-1) és 29 perc (PlGF), a minta térfogata pedig 9 µl, illetve 70 µl. A vizsgálatokat rekombináns humán sFlt-1-gyel és PIGF-fel kalibráltuk, és a Quantikine PIGF ELISA-val (R&D Systems Europe Ltd, Abingdon, Egyesült Királyság) és az sFlt-1 Elecsys-teszttel (Elecsys, Penzberg, Németország) szemben standardizáltuk. A gyártó használati utasítása szerint a KRYPTOR sFlt-1 teszt 22-90 000 pg/ml mérési tartományt fed le. A kimutatási határ 22 pg/ml, a kvantálás határa (funkcionális érzékenység) 29 pg/ml. Az 1540 pg/ml sFlt-1 koncentrációnál az intra- és inter-assay eltérések 0,3%, illetve 0,8%; 2988 pg/ml-nél 0,5% és 1,1%; és 9666 pg/ml-nél 0,5%, illetve 1,0%. A KRYPTOR PlGF vizsgálat 3,6-7,000 mérési tartományt fed le pg/ml. A kimutatási határ 3,6 pg/ml, a mennyiségi meghatározás határa 6,9 pg/ml. Az intra- és inter-assay eltérések 35 pg/ml PlGF-koncentráció mellett 4,6%, illetve 7,3%; 103 pg/ml-nél 2,1% és 3,1%, 430 pg/ml-nél 0,9% és 2,3%.
• Az Elecsys sFlt-1 és PIGF tesztekhez a méréseket teljesen automatizált Elecsys rendszeren (Elecsys, Penzberg, Németország) végeztük a gyártó utasításai szerint. Az Elecsys vizsgálatok szendvics immunoassay-k, amelyek az elektrokemilumineszcencia technológián alapulnak. A vizsgálatok teljes időtartama 18 perc, a minta térfogata 20 µl az sFlt-1 és 50 µl a PIGF esetében. A vizsgálatokat rekombináns humán PIGF-fel és sFlt-1-gyel kalibráltuk, és a Quantikine PIGF-fel és a vaszkuláris endoteliális növekedési faktor-R1 ELISA-val (R&D Systems, Minneapolis, MN) standardizáltuk. A gyártó használati utasítása szerint az Elecsys sFlt-1 teszt 10-85 000 pg/ml, az Elecsys PIGF teszt 3-10 000 pg/ml mérési tartományt fed le. A kimutatási határ 10 pg/ml (sFlt-1) és 3 pg/ml (PIGF). A kvantálás határa 15 pg/ml az sFlt-1 és 10 pg/ml a PIGF esetében.

A D-vitamin és az angiogén marker 1. vizsgálata:

D-vitamin és angiogén markerek a terhesség korai szakaszában. Epidemiológia és összefüggések a korai terhesség vetélésével

• A terhesség korai szakaszában gyűjtött 1728 szérummintában a szérum 25(OH)D szintjét LC-MS/MS-sel, az sFlt-1 és PlGF szintjét pedig 1720 mintában immunoassay-vel határoztuk meg. Kérdőíves és orvosi dokumentációs információkat használtunk a 25(OH)D-szintre és az sFlt/PlGF-re a korai terhességben befolyásoló tényezők meghatározására többszörös lineáris regresszióval és logisztikus regresszióval.
• A 22+0 hetes gesztációs kor előtt gyűjtött 1675 szérummintában analízist végeztünk az sFlt-1 és a PlGF mint a vetélés biomarkerei prediktív tulajdonságainak értékelésére (n=59).
• A 22+0 hetes terhességi kor előtt gyűjtött 1684 szérummintában a 25(OH)D szinteket hasonlították össze a később spontán abortuszt elszenvedett nők (n=59) és a populáció többi részének, kiválasztott kovariánsokkal korrigálva.