Vitamin D a angiogenní markery v dětské kohortě Odense 1 (VITAM)

Celkově: Odense Child Cohort Study (OCC) je populační kohortová studie zahrnující těhotné ženy přijaté mezi 1. lednem 2010 a 31. prosincem 2012. Všechny ženy, které byly během této doby v obci Odense těhotné, se mohly zúčastnit a 6 707 žen bylo osloveno přímo s náborovým materiálem.

Studie byla v souladu s Helsinskou deklarací a byla schválena Regionálním vědeckým etickým výborem pro jižní Dánsko, č. S-20090130. Všichni účastníci dali informovaný souhlas. Z populační základny 6 707 těhotných žen se do OCC do 31. prosince 2012 zapsalo 2 874 (42,9 %). Děti budou sledovány do 18 let.

Vzorky séra byly odebrány v časném těhotenství (GA 2-25 týdnů), v pozdním těhotenství (GA 26-30 týdnů), mateřské sérum a pupečníková krev při porodu a od dětí spolu s celkovým vyšetřením ve věku 3 měsíce, 1 rok, 3 let.

Dotazníky vyplňovaly rodiny v časném těhotenství, v pozdním těhotenství, po porodu a v době klinického vyšetření dětí.

Údaje z registrů o zdravotních proměnných byly dále dostupné z dánských registrů.

Cíl: Studie 1 vitaminu D a angiogenních markerů zkoumá vztah mezi sérovými biomarkery 25(OH)D a rozpustnou Fms-like kinázou 1 (sFlt-1) a placentárním růstovým faktorem (PlGF) v těhotenství a rizikem potratu jako nepříznivým výsledkem v časném těhotenství.

Metoda:

• Analýza 25(OH)D: Sérum bylo skladováno při -80 °C až do analýzy, která byla provedena pomocí kapalinové chromatografie a hmotnostní spektrometrie (LC-MS/MS). Trojité deuterium označené 25(OH)vitamin D3 bylo přidáno do vzorků séra jako vnitřní standard a deproteinováno pomocí ZnSO4 v methanolu, centrifugováno při 2750 g po dobu 10 minut a 100 μl bylo nastříknuto na kolonu TurboFlow (Thermo Scientific) na LC-MS /SLEČNA. LC-MS/MS sestával ze systému Thermo Scientific TLX1 připojeného k Thermo Scientific Vantage TSQ. 25(OH)D2 a 25(OH)D3 byly koncentrovány na koloně Thermo Scientific Cyclone P 50 x 1,0 mm a zpětně propláchnuty na analytické koloně Phenomenex Gemini C18 50 x 3,0 mm a eluovány z analytické kolony gradientem. Mobilní fáze byly A: 10 mM NH4Ac ve vodě a B: 10 mM NH4Ac v methanolu. Lidské sérum bylo obohaceno příslušnými množstvími 25(OH)D2 a 25(OH)D3, aby se vytvořily šestibodové kalibrační křivky (vážené 1/x2) a 3 úrovně vzorků QC (nízká, střední, vysoká). Metoda byla kalibrována podle standardu NIST 972.25 Epimer C3 z D3 byl detekován spolu s D3 a oba od sebe nebyly odlišitelné. Nejnižší detekovatelné koncentrace byly 0,15 nM pro D2 i D3. Hodnoty D2 a D3 byly brány v úvahu pouze v případě, že byly vyšší než 6,5 nM.
• Měření pro testy BRAHMS sFlt-1 a PIGF KRYPTOR byla provedena na plně automatizovaném systému KRYPTOR compact Plus (KRYPTOR PlGF a KRYPTOR sFlt-1; Thermo Fisher Scientific) podle pokynů výrobce. Testy BRAHMS sFlt-1 a PlGF KRYPTOR jsou homogenní sendvičové imunotesty založené na technologii Trace24. Celková doba trvání testů je 9 minut (sFlt-1) a 29 minut (PlGF) a objem vzorku je 9 µl, respektive 70 µl. Testy jsou kalibrovány s rekombinantním lidským sFlt-1 a PIGF a standardizovány proti testu Quantikine PIGF ELISA (R&D Systems Europe Ltd, Abingdon, UK) a proti testu sFlt-1 Elecsys (Elecsys, Penzberg, Německo). Podle návodu výrobce k použití pokrýval test KRYPTOR sFlt-1 rozsah měření 22-90 000 pg/ml. Mez detekce je 22 pg/ml a mez kvantizace (funkční citlivost) je 29 pg/ml. Intra- a inter-testové variace při koncentraci sFlt-1 1540 pg/ml jsou 0,3 % a 0,8 %, v daném pořadí; při 2988 pg/ml 0,5 % a 1,1 %; a při 9666 pg/ml 0,5 % a 1,0 %, v daném pořadí. Test KRYPTOR PlGF pokrývá rozsah měření 3,6-7 000 pg/ml. Mez detekce je 3,6 pg/ml a mez kvantifikace je 6,9 ​​pg/ml. Intra- a inter-testové variace při koncentraci P1GF 35 pg/ml jsou 4,6 % a 7,3 %, v daném pořadí; při 103 pg/ml 2,1 % a 3,1 % a při 430 pg/ml 0,9 % a 2,3 %, v daném pořadí.
• Měření pro testy Elecsys sFlt-1 a PIGF byla provedena na plně automatizovaném systému Elecsys (Elecsys, Penzberg, Německo) podle pokynů výrobce. Testy Elecsys jsou sendvičové imunotesty založené na elektrochemiluminiscenční technologii. Celková doba trvání testů je 18 minut a objem vzorku je 20 ul pro sFlt-1 a 50 ul pro PIGF. Testy jsou kalibrovány s rekombinantním lidským PIGF a sFlt-1 a standardizovány podle testů ELISA Quantikine PIGF a vaskulárního endoteliálního růstového faktoru-R1 (R&D Systems, Minneapolis, MN). Podle návodu výrobce k použití pokrývá stanovení Elecsys sFlt-1 rozsah měření od 10-85 000 pg/ml, stanovení Elecsys PIGF od 3-10 000 pg/ml. Limit detekce je 10 pg/ml (sFlt-1) a 3 pg/ml (PIGF). Limit kvantifikace je 15 pg/ml pro sFlt-1 a 10 pg/ml pro PIGF.

Studie vitaminu D a angiogenních markerů 1:

Vitamin D a angiogenní markery v časném těhotenství. Epidemiologie a souvislosti s potratem v raném těhotenství

• V 1728 vzorcích séra odebraných v časném těhotenství byly hladiny séra 25(OH)D vyšetřeny pomocí LC-MS/MS a hladiny sFlt-1 a PlGF byly stanoveny imunotesty u 1720 vzorků. Informace z dotazníku a lékařské dokumentace byly použity k určení faktorů, které měly vliv na hladiny 25(OH)D a sFlt/PlGF v časném těhotenství pomocí mnohočetné lineární regrese a logistické regrese.
• U 1675 vzorků séra odebraných před gestačním věkem 22+0 týdnů byla provedena analýza k vyhodnocení prediktivních vlastností hladin sFlt-1 a PlGF jako biomarkerů potratu (n=59).
• V 1684 vzorcích séra odebraných před gestačním věkem 22+0 týdnů byly hladiny 25(OH)D porovnány mezi ženami, které následně prodělaly spontánní potraty (n=59) a zbytkem populace, korigované na vybrané kovariáty.