Vitamin D und angiogene Marker in Odense-Kinderkohorte 1 (VITAM)

Insgesamt: Die Odense Child Cohort Study (OCC) ist eine populationsbasierte Kohortenstudie, die zwischen dem 1. Januar 2010 und dem 31. Dezember 2012 rekrutierte schwangere Frauen umfasst. Alle Frauen, die in dieser Zeit in der Gemeinde Odense schwanger waren, kamen zur Teilnahme in Frage, und 6.707 Frauen wurden direkt mit Rekrutierungsmaterial angesprochen.

Die Studie entsprach der Deklaration von Helsinki und wurde von der regionalen wissenschaftlichen Ethikkommission für Süddänemark, Nr. S-20090130. Alle Teilnehmer gaben ihre informierte Zustimmung. Von einer Bevölkerungsbasis von 6.707 schwangeren Frauen waren bis zum 31. Dezember 2012 2.874 (42,9 %) im OCC eingeschrieben. Die Kinder werden bis zum Alter von 18 Jahren betreut.

Serumproben wurden in der Frühschwangerschaft (GA 2-25 Wochen), Spätschwangerschaft (GA 26-30 Wochen), mütterliches Serum und Nabelschnurblut bei der Geburt und von den Kindern zusammen mit allgemeinen Untersuchungen im Alter von 3 Monaten, 1 Jahr, 3 entnommen Jahre.

Fragebögen wurden von den Familien in der Frühschwangerschaft, Spätschwangerschaft, nach der Geburt und bei der klinischen Untersuchung der Kinder ausgefüllt.

Registerdaten zu Gesundheitsvariablen waren außerdem bei den dänischen Registern verfügbar.

Ziel: Die Studie 1 zu Vitamin D und angiogenen Markern untersucht die Beziehung zwischen den Serumbiomarkern 25(OH)D und löslicher Fms-ähnlicher Kinase 1 (sFlt-1) und Plazenta-Wachstumsfaktor (PlGF) in der Schwangerschaft und dem Risiko einer Fehlgeburt als unerwünschtes Ergebnis in der Frühschwangerschaft.

Methode:

• 25(OH)D-Analyse: Das Serum wurde bis zur Analyse, die durch Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) durchgeführt wurde, bei –80 °Celsius gelagert. Dreifach mit Deuterium markiertes 25(OH)Vitamin D3 wurde den Serumproben als interner Standard zugesetzt und mit ZnSO4 in Methanol deproteinisiert, bei 2750 g für 10 Minuten zentrifugiert und 100 μl wurden auf die TurboFlow-Säule (Thermo Scientific) auf dem LC-MS injiziert /MS. Das LC-MS/MS bestand aus einem Thermo Scientific TLX1-System, das mit einem Thermo Scientific Vantage TSQ verbunden war. 25(OH)D2 und 25(OH)D3 wurden auf einer Thermo Scientific Cyclone P 50 x 1,0 mm Säule konzentriert und auf die analytische Säule Phenomenex Gemini C18 50 x 3,0 mm rückgespült und von der analytischen Säule durch einen Gradienten eluiert. Mobile Phasen waren A: 10 mM NH4Ac in Wasser und B: 10 mM NH4Ac in Methanol. Humanserum wurde mit geeigneten Mengen von 25(OH)D2 und 25(OH)D3 versetzt, um Sechspunkt-Kalibrierungskurven (1/x2 gewogen) und 3 Niveaus von QC-Proben (niedrig, mittel, hoch) zu erstellen. Die Methode wurde gegen den NIST-Standard 972.25 kalibriert Das C3-Epimer von D3 wurde zusammen mit D3 nachgewiesen und die beiden waren nicht voneinander unterscheidbar. Die niedrigsten nachweisbaren Konzentrationen waren 0,15 nM für D2 und D3. Werte von D2 und D3 wurden nur berücksichtigt, wenn sie über 6,5 nM lagen.
• Messungen für BRAHMS sFlt-1- und PIGF-KRYPTOR-Assays wurden auf dem vollautomatischen KRYPTOR compact Plus-System (KRYPTOR PlGF und KRYPTOR sFlt-1; Thermo Fisher Scientific) gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Die BRAHMS sFlt-1 und PlGF KRYPTOR Assays sind homogene Sandwich-Immunoassays basierend auf der Trace-Technologie24. Die Gesamtdauer der Assays beträgt 9 Minuten (sFlt-1) und 29 Minuten (PlGF) und das Probenvolumen beträgt 9 µl bzw. 70 µl. Die Assays werden mit rekombinantem humanem sFlt-1 und PLGF kalibriert und gegen den Quantikine PIGF ELISA (R&D Systems Europe Ltd, Abingdon, UK) und gegen den sFlt-1 Elecsys Assay (Elecsys, Penzberg, Deutschland) standardisiert. Laut Gebrauchsanweisung des Herstellers deckte der KRYPTOR sFlt-1 Assay einen Messbereich von 22-90.000 pg/ml ab. Die Nachweisgrenze liegt bei 22 pg/ml und die Bestimmungsgrenze (funktionelle Sensitivität) bei 29 pg/ml. Die Intra- und Inter-Assay-Variationen bei einer sFlt-1-Konzentration von 1540 pg/ml betragen 0,3 % bzw. 0,8 %; bei 2988 pg/ml 0,5 % und 1,1 %; und bei 9666 pg/ml 0,5 % bzw. 1,0 %. Der KRYPTOR PlGF Assay deckt einen Messbereich von 3,6-7.000 ab pg/ml. Die Nachweisgrenze liegt bei 3,6 pg/ml und die Bestimmungsgrenze bei 6,9 pg/ml. Die Intra- und Inter-Assay-Variationen bei einer PlGF-Konzentration von 35 pg/ml betragen 4,6 % bzw. 7,3 %; bei 103 pg/ml 2,1 % und 3,1 % und bei 430 pg/ml 0,9 % bzw. 2,3 %.
• Messungen für Elecsys sFlt-1- und PLGF-Assays wurden auf dem vollautomatischen Elecsys-System (Elecsys, Penzberg, Deutschland) gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Die Elecsys-Assays sind Sandwich-Immunoassays, die auf der Elektrochemilumineszenz-Technologie basieren. Die Gesamtdauer der Assays beträgt 18 Minuten und das Probenvolumen beträgt 20 &mgr;l für sFlt-1 und 50 &mgr;l für PLGF. Die Assays werden mit rekombinantem humanem PLGF und sFlt-1 kalibriert und gegen die ELISAs Quantikine PIGF und Vascular Endothelial Growth Factor-R1 (R&D Systems, Minneapolis, MN) standardisiert. Laut Gebrauchsanweisung des Herstellers deckt der Elecsys sFlt-1 Assay einen Messbereich von 10-85.000 pg/ml ab, der Elecsys PIGF Assay von 3-10.000 pg/ml. Die Nachweisgrenze liegt bei 10 pg/ml (sFlt-1) und 3 pg/ml (PIGF). Die Quantisierungsgrenze beträgt 15 pg/ml für sFlt-1 und 10 pg/ml für PLGF.

Die Studie 1 zu Vitamin D und angiogenen Markern:

Vitamin D und angiogene Marker in der Frühschwangerschaft. Epidemiologie und Assoziationen zu Fehlgeburten in der Frühschwangerschaft

• In 1728 in der Frühschwangerschaft gesammelten Serumproben wurden die Serumspiegel von 25(OH)D mittels LC-MS/MS untersucht und die Spiegel von sFlt-1 und PlGF durch Immunoassays in 1720 Proben bestimmt. Informationen aus Fragebögen und Krankenakten wurden verwendet, um die Faktoren zu bestimmen, die einen Einfluss auf die 25(OH)D-Spiegel und sFlt/PlGF in der Frühschwangerschaft durch multiple lineare Regression und logistische Regression hatten.
• In 1675 Serumproben, die vor dem Gestationsalter 22+0 Wochen entnommen wurden, wurde eine Analyse durchgeführt, um die prädiktiven Eigenschaften der sFlt-1- und PlGF-Spiegel als Biomarker einer Fehlgeburt zu bewerten (n=59).
• In 1684 Serumproben, die vor dem Schwangerschaftsalter von 22+0 Wochen entnommen wurden, wurden die 25(OH)D-Spiegel zwischen Frauen, die später spontane Aborte erlitten (n=59), und dem Rest der Bevölkerung verglichen, korrigiert um ausgewählte Kovariaten.