Witamina D i markery angiogenne w kohorcie dziecięcej Odense 1 (VITAM)

Ogólnie: The Odense Child Cohort Study (OCC) to populacyjne badanie kohortowe, obejmujące kobiety w ciąży rekrutowane między 1 stycznia 2010 a 31 grudnia 2012. Wszystkie kobiety, które były w ciąży w gminie Odense w tym czasie, kwalifikowały się do udziału, a 6707 kobiet otrzymało bezpośrednio materiały rekrutacyjne.

Badanie było zgodne z Deklaracją Helsińską i zostało zatwierdzone przez Regionalną Naukową Komisję Etyczną dla Południowej Danii, nr. S-20090130. Wszyscy uczestnicy wyrazili świadomą zgodę. Z populacji liczącej 6 707 kobiet w ciąży 2 874 (42,9%) zapisało się do OCC do 31 grudnia 2012 r. Dzieci będą obserwowane do 18 roku życia.

Próbki surowicy pobierano we wczesnej ciąży (GA 2-25 tyg.), późnej ciąży (GA 26-30 tyg.), surowicy matki i krwi pępowinowej przy urodzeniu oraz od dzieci wraz z badaniami ogólnymi w wieku 3 miesięcy, 1 rok, 3 lata. lata.

Ankiety były wypełniane przez rodziny we wczesnej ciąży, późnej ciąży, po urodzeniu oraz w czasie badania klinicznego dzieci.

Dane rejestrowe dotyczące zmiennych dotyczących zdrowia były dalej dostępne w duńskich rejestrach.

Cel: Badanie 1 witaminy D i markerów angiogennych bada związek między biomarkerami surowicy 25(OH)D i rozpuszczalną kinazą podobną do Fms 1 (sFlt-1) i łożyskowym czynnikiem wzrostu (PlGF) w ciąży a ryzykiem poronienia jako skutkiem niepożądanym we wczesnej ciąży.

Metoda:

• Analiza 25(OH)D: Surowicę przechowywano w temperaturze -80°C do czasu analizy, którą przeprowadzono metodą chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas (LC-MS/MS). Potrójny deuter oznaczony jako 25(OH)witamina D3 dodano do próbek surowicy jako standard wewnętrzny i odbiałczono ZnSO4 w metanolu, odwirowano przy 2750 g przez 10 minut, a 100 μl wstrzyknięto na kolumnę TurboFlow (Thermo Scientific) na LC-MS /SM. LC-MS/MS składał się z systemu Thermo Scientific TLX1 połączonego z Thermo Scientific Vantage TSQ. 25(OH)D2 i 25(OH)D3 zatężono na kolumnie Thermo Scientific Cyclone P 50 x 1,0 mm i przepłukano wstecznie na kolumnie analitycznej Phenomenex Gemini C18 50 x 3,0 mm i eluowano z kolumny analitycznej gradientem. Fazy ​​ruchome to A: 10 mM NH4Ac w wodzie i B: 10 mM NH4Ac w metanolu. Do surowicy ludzkiej dodano odpowiednie ilości 25(OH)D2 i 25(OH)D3 w celu uzyskania sześciopunktowych krzywych kalibracyjnych (zważonych 1/x2) i 3 poziomów próbek QC (niski, średni, wysoki). Metodę skalibrowano względem standardu NIST 972.25 Epimer C3 z D3 wykryto razem z D3 i tych dwóch nie można było odróżnić od siebie. Najniższe wykrywalne stężenia wynosiły 0,15 nM zarówno dla D2, jak i D3. Wartości D2 i D3 były brane pod uwagę tylko wtedy, gdy przekraczały 6,5 nM.
• Pomiary do testów BRAHMS sFlt-1 i PIGF KRYPTOR przeprowadzono na w pełni zautomatyzowanym systemie KRYPTOR compact Plus (KRYPTOR PlGF i KRYPTOR sFlt-1; Thermo Fisher Scientific) zgodnie z instrukcjami producenta. Testy BRAHMS sFlt-1 i PlGF KRYPTOR to jednorodne testy immunologiczne oparte na technologii Trace24. Całkowity czas trwania testów wynosi 9 minut (sFlt-1) i 29 minut (PlGF), a objętość próbki wynosi odpowiednio 9 µl i 70 µl. Testy kalibruje się z rekombinowanym ludzkim sFlt-1 i PIGF i standaryzuje względem testu Quantikine PIGF ELISA (R&D Systems Europe Ltd, Abingdon, Wielka Brytania) i względem testu sFlt-1 Elecsys (Elecsys, Penzberg, Niemcy). Zgodnie z instrukcją producenta test KRYPTOR sFlt-1 obejmował zakres pomiarowy 22-90 000 pg/ml. Granica wykrywalności wynosi 22 pg/ml, a granica kwantyzacji (czułość funkcjonalna) wynosi 29 pg/ml. Zmienność wewnątrz- i między-testowa przy stężeniu sFlt-1 wynoszącym 1540 pg/ml wynosi odpowiednio 0,3% i 0,8%; przy 2988 pg/ml 0,5% i 1,1%; i przy 9666 pg/ml odpowiednio 0,5% i 1,0%. Test KRYPTOR PlGF obejmuje zakres pomiarowy 3,6-7.000 pg/ml. Granica wykrywalności wynosi 3,6 pg/ml, a granica oznaczalności 6,9 pg/ml. Zmienność wewnątrz- i między-testowa przy stężeniu PlGF 35 pg/ml wynosi odpowiednio 4,6% i 7,3%; przy 103 pg/ml odpowiednio 2,1% i 3,1% oraz przy 430 pg/ml odpowiednio 0,9% i 2,3%.
• Pomiary do testów Elecsys sFlt-1 i PIGF przeprowadzono na w pełni zautomatyzowanym systemie Elecsys (Elecsys, Penzberg, Niemcy) zgodnie z instrukcjami producenta. Testy Elecsys to kanapkowe testy immunologiczne oparte na technologii elektrochemiluminescencyjnej. Całkowity czas trwania testów wynosi 18 minut, a objętość próbki wynosi 20 µl dla sFlt-1 i 50 µl dla PIGF. Testy kalibruje się z użyciem rekombinowanego ludzkiego PIGF i sFlt-1 i standaryzuje względem testów ELISA Quantikine PIGF i czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego-R1 (R&D Systems, Minneapolis, MN). Zgodnie z instrukcją producenta, test Elecsys sFlt-1 obejmuje zakres pomiarowy od 10-85 000 pg/ml, test Elecsys PIGF od 3-10 000 pg/ml. Granica wykrywalności wynosi 10 pg/ml (sFlt-1) i 3 pg/ml (PIGF). Granica kwantyzacji wynosi 15 pg/ml dla sFlt-1 i 10 pg/ml dla PIGF.

Badanie witaminy D i markerów angiogennych 1:

Witamina D i markery angiogenne we wczesnej ciąży. Epidemiologia i związki z poronieniami we wczesnej ciąży

• W 1728 próbkach surowicy pobranych we wczesnej ciąży poziom 25(OH)D w surowicy zbadano metodą LC-MS/MS, a poziomy sFlt-1 i PlGF określono za pomocą testów immunologicznych w 1720 próbkach. Kwestionariusz i informacje z dokumentacji medycznej wykorzystano do określenia czynników, które miały wpływ na poziomy 25(OH)D i sFlt/PlGF we wczesnej ciąży za pomocą wielokrotnej regresji liniowej i regresji logistycznej.
• W 1675 próbkach surowicy pobranych przed 22+0 tygodniem ciąży przeprowadzono analizę w celu oceny właściwości predykcyjnych poziomów sFlt-1 i PlGF jako biomarkerów poronienia (n=59).
• W 1684 próbkach surowicy pobranych przed 22+0 tygodniem ciąży porównano poziomy 25(OH)D między kobietami, które następnie doznały samoistnych poronień (n=59) i resztą populacji, skorygowane o wybrane współzmienne.