D-vitamiini ja angiogeeniset markkerit Odensen lapsikohortissa 1 (VITAM)

Yleisesti: Odense Child Cohort Study (OCC) on väestöpohjainen kohorttitutkimus, joka käsittää raskaana olevia naisia, jotka on värvätty 1. tammikuuta 2010 ja 31. joulukuuta 2012 välisenä aikana. Kaikki tänä aikana Odensen kunnassa raskaana olleet naiset olivat oikeutettuja osallistumaan, ja 6 707 naista lähestyttiin suoraan rekrytointimateriaalilla.

Tutkimus noudatti Helsingin julistusta ja sen hyväksyi Etelä-Tanskan alueellinen tieteellinen eettinen komitea, nro. S-20090130. Kaikki osallistujat antoivat tietoisen suostumuksen. 6 707 raskaana olevan naisen väestöpohjasta 2 874 (42,9 %) ilmoittautui OCC:hen 31. joulukuuta 2012 mennessä. Lapsia seurataan 18-vuotiaaksi asti.

Seeruminäytteet otettiin raskauden alkuvaiheessa (GA 2-25 viikkoa), myöhäisessä raskaudessa (GA 26-30 viikkoa), äidin seerumi- ja napanuoraverestä syntyessä sekä lapsilta yleisten tutkimusten iässä 3 kuukautta, 1 vuotta, 3 vuotta.

Perheet täyttivät kyselyt alkuraskauden aikana, raskauden loppuvaiheessa, synnytyksen jälkeen ja lasten kliinisen tutkimuksen aikana.

Rekisteritietoja terveysmuuttujista oli edelleen saatavilla Tanskan rekistereistä.

Tavoite: D-vitamiinin ja angiogeenisten markkerien tutkimus 1 tutkii seerumin biomarkkerien 25(OH)D:n ja liukoisen Fms:n kaltaisen kinaasi 1:n (sFlt-1) ja istukan kasvutekijän (PlGF) välistä suhdetta raskauden aikana ja keskenmenon riskiä haittavaikutuksena raskauden alkuvaiheessa.

Menetelmä:

• 25(OH)D-analyysi: Seerumia säilytettiin -80 °C:ssa analyysiin asti, joka suoritettiin nestekromatografian massaspektrometrialla (LC-MS/MS). Kolmoisdeuterium, joka oli merkitty 25(OH)-D3-vitamiinilla, lisättiin seeruminäytteisiin sisäisenä standardina ja proteiini poistettiin ZnSO4:lla metanolissa, sentrifugoitiin 2750 g:ssä 10 minuuttia ja 100 μl injektoitiin TurboFlow-kolonniin (Thermo Scientific) LC-MS:llä. /NEITI. LC-MS/MS koostui Thermo Scientific TLX1 -järjestelmästä, joka oli kytketty Thermo Scientific Vantage TSQ:han. 25(OH)D2 ja 25(OH)D3 konsentroitiin Thermo Scientific Cyclone P 50 x 1,0 mm pylvääseen ja huuhdeltiin takaisin analyyttiselle pylväälle, Phenomenex Gemini C18 50 x 3,0 mm ja eluoitiin analyysipylväästä gradientilla. Liikkuvat faasit olivat A: 10 mM NH4Ac vedessä ja B: 10 mM NH4Ac metanolissa. Ihmisseerumiin lisättiin sopivia määriä 25(OH)D2:ta ja 25(OH)D3:a kuuden pisteen kalibrointikäyrän (punnitus 1/x2) ja 3 QC-näytteiden (matala, keski, korkea) tuottamiseksi. Menetelmä kalibroitiin NIST-standardin 972.25 mukaan D3:n C3-epimeeri havaittiin yhdessä D3:n kanssa, eivätkä nämä kaksi olleet erotettavissa toisistaan. Alhaisimmat havaittavat pitoisuudet olivat 0,15 nM sekä D2:lle että D3:lle. D2- ja D3-arvot otettiin huomioon vain, jos ne olivat yli 6,5 nM.
• Mittaukset BRAHMS sFlt-1- ja PIGF KRYPTOR -määrityksille suoritettiin täysin automatisoidulla KRYPTOR compact Plus -järjestelmällä (KRYPTOR PlGF ja KRYPTOR sFlt-1; Thermo Fisher Scientific) valmistajan ohjeiden mukaisesti. BRAHMS sFlt-1- ja PlGF KRYPTOR -määritykset ovat homogeenisia sandwich-immunomäärityksiä, jotka perustuvat Trace-tekniikkaan24. Määritysten kokonaiskesto on 9 minuuttia (sFlt-1) ja 29 minuuttia (PlGF) ja näytetilavuus on vastaavasti 9 µl ja 70 µl. Määritykset kalibroidaan rekombinantilla ihmisen sFlt-1:llä ja PIGF:llä ja standardisoidaan Quantikine PIGF ELISA:ta (R&D Systems Europe Ltd, Abingdon, UK) ja sFlt-1 Elecsys -määritystä (Elecsys, Penzberg, Saksa) vastaan. Valmistajan käyttöohjeen mukaan KRYPTOR sFlt-1 -määritys kattoi mittausalueen 22-90 000 pg/ml. Havaitsemisraja on 22 pg/ml ja kvantisoinnin (toiminnallinen herkkyys) raja on 29 pg/ml. Testien sisäiset ja väliset vaihtelut sFlt-1-pitoisuudella 1540 pg/ml ovat 0,3 % ja 0,8 %, vastaavasti; pitoisuudella 2988 pg/ml 0,5 % ja 1,1 %; ja 9666 pg/ml 0,5 % ja 1,0 %, vastaavasti. KRYPTOR PlGF -määritys kattaa mittausalueen 3,6-7 000 pg/ml. Havaitsemisraja on 3,6 pg/ml ja kvantifiointiraja 6,9 pg/ml. Testien sisäiset ja väliset vaihtelut PlGF-pitoisuudella 35 pg/ml ovat 4,6 % ja 7,3 %, vastaavasti; 103 pg/ml 2,1 % ja 3,1 % ja 430 pg/ml 0,9 % ja 2,3 %.
• Mittaukset Elecsys sFlt-1- ja PIGF-määrityksille suoritettiin täysin automatisoidulla Elecsys-järjestelmällä (Elecsys, Penzberg, Saksa) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Elecsys-analyysit ovat sandwich-immunomäärityksiä, jotka perustuvat elektrokemiluminesenssiteknologiaan. Määritysten kokonaiskesto on 18 minuuttia ja näytetilavuus on 20 µl sFlt-1:lle ja 50 µl PIGF:lle. Määritykset kalibroidaan rekombinantilla ihmisen PIGF:llä ja sFlt-1:llä ja standardisoidaan Quantikine PIGF- ja verisuonten endoteelikasvutekijä-R1-ELISA-testejä (R&D Systems, Minneapolis, MN) vastaan. Valmistajan käyttöohjeen mukaan Elecsys sFlt-1 -määritys kattaa mittausalueen 10-85 000 pg/ml, Elecsys PIGF -määritys 3-10 000 pg/ml. Havaitsemisraja on 10 pg/ml (sFlt-1) ja 3 pg/ml (PIGF). Kvantisoinnin raja on 15 pg/ml sFlt-1:lle ja 10 pg/ml PIGF:lle.

D-vitamiinin ja angiogeenisten merkkiaineiden tutkimus 1:

D-vitamiini ja angiogeeniset markkerit raskauden alkuvaiheessa. Epidemiologia ja assosiaatiot varhaisen raskauden keskenmenoon

• Raskauden alkuvaiheessa kerätyistä 1728 seeruminäytteestä seerumin 25(OH)D-tasot tutkittiin LC-MS/MS:llä ja sFlt-1- ja PlGF-tasot määritettiin immuunimäärityksillä 1720 näytteestä. Kyselylomaketta ja lääketieteellisten tiedostojen tietoja käytettiin määrittämään tekijät, jotka vaikuttivat 25(OH)D-tasoihin ja sFlt/PlGF:ään raskauden alkuvaiheessa moninkertaisella lineaarisella regressiolla ja logistisella regressiolla.
• 1675 seeruminäytteessä, jotka kerättiin ennen raskausikää 22+0 viikkoa, suoritettiin analyysi sFlt-1- ja PlGF-tasojen ennustavien ominaisuuksien arvioimiseksi keskenmenon biomarkkereina (n=59).
• 1684 seeruminäytteessä, jotka otettiin ennen raskausikää 22+0 viikkoa, 25(OH)D-tasoja verrattiin myöhemmin spontaaniin aborttiin kärsineiden naisten (n=59) ja muun väestön välillä valituilla yhteismuuttujilla korjattuna.