Vitamina D e marcatori angiogenici nella coorte di bambini di Odense 1 (VITAM)

Complessivamente: l'Odense Child Cohort Study (OCC) è uno studio di coorte basato sulla popolazione, comprendente donne in gravidanza reclutate tra il 1° gennaio 2010 e il 31 dicembre 2012. Tutte le donne incinte nel comune di Odense durante questo periodo erano idonee a partecipare e 6.707 donne sono state contattate direttamente con materiale di reclutamento.

Lo studio è conforme alla dichiarazione di Helsinki ed è stato approvato dal Comitato etico scientifico regionale per la Danimarca meridionale, n. S-20090130. Tutti i partecipanti hanno dato il consenso informato. Su una base di popolazione di 6.707 donne incinte, 2.874 (42,9%) si sono iscritte all'OCC fino al 31 dicembre 2012. I ragazzi saranno seguiti fino ai 18 anni di età.

I campioni di siero sono stati prelevati all'inizio della gravidanza (GA 2-25 settimane), alla fine della gravidanza (GA 26-30 settimane), al siero materno e al sangue del cordone ombelicale alla nascita e dai bambini insieme agli esami generali all'età di 3 mesi, 1 anno, 3 anni.

I questionari sono stati completati dalle famiglie all'inizio della gravidanza, alla fine della gravidanza, dopo la nascita e al momento dell'esame clinico dei bambini.

I dati di registro sulle variabili sanitarie erano ulteriormente disponibili dai registri danesi.

Obiettivo: il Vitamin D and Angiogenic Marker Study 1 esamina la relazione tra i biomarcatori sierici 25(OH)D e la chinasi solubile Fms-like 1 (sFlt-1) e il fattore di crescita placentare (PlGF) in gravidanza e il rischio di aborto spontaneo come esito avverso all'inizio della gravidanza.

Metodo:

• Analisi 25(OH)D: il siero è stato conservato a -80º Celsius fino all'analisi, che è stata eseguita mediante spettrometria di massa con cromatografia liquida (LC-MS/MS). Il triplo deuterio marcato con 25 (OH) vitamina D3 è stato aggiunto ai campioni di siero come standard interno e deproteinizzato con ZnSO4 in metanolo, centrifugato a 2750 g per 10 minuti e 100 μl sono stati iniettati sulla colonna TurboFlow (Thermo Scientific) su LC-MS /SM. L'LC-MS/MS consisteva in un sistema Thermo Scientific TLX1 collegato a un Thermo Scientific Vantage TSQ. 25(OH)D2 e 25(OH)D3 sono stati concentrati su una colonna Thermo Scientific Cyclone P 50 x 1,0 mm e lavati in controcorrente sulla colonna analitica, Phenomenex Gemini C18 50 x 3,0 mm ed eluiti dalla colonna analitica mediante un gradiente. Le fasi mobili erano A: NH4Ac 10 mM in acqua e B: NH4Ac 10 mM in metanolo. Il siero umano è stato arricchito con quantità appropriate di 25(OH)D2 e 25(OH)D3 per produrre curve di calibrazione a sei punti (pesate 1/x2) e 3 livelli di campioni QC (basso, medio, alto). Il metodo è stato calibrato rispetto allo standard NIST 972.25 L'epimero C3 di D3 è stato rilevato insieme a D3 e i due non erano distinguibili l'uno dall'altro. Le concentrazioni rilevabili più basse erano 0,15 nM sia per D2 che per D3. I valori di D2 e ​​D3 sono stati considerati solo se superiori a 6,5 ​​nM.
• Le misurazioni per i saggi BRAHMS sFlt-1 e PIGF KRYPTOR sono state eseguite sul sistema KRYPTOR compact Plus completamente automatizzato (KRYPTOR PlGF e KRYPTOR sFlt-1; Thermo Fisher Scientific) secondo le istruzioni del produttore. I test BRAHMS sFlt-1 e PlGF KRYPTOR sono immunodosaggi a sandwich omogenei basati sulla tecnologia Trace24. La durata totale delle analisi è di 9 minuti (sFlt-1) e 29 minuti (PlGF) e il volume del campione è rispettivamente di 9 µl e 70 µl. I test sono calibrati con sFlt-1 umano ricombinante e PIGF e standardizzati contro Quantikine PIGF ELISA (R&D Systems Europe Ltd, Abingdon, Regno Unito) e contro il test sFlt-1 Elecsys (Elecsys, Penzberg, Germania). Secondo le istruzioni per l'uso del produttore, il test KRYPTOR sFlt-1 copriva un intervallo di misurazione di 22-90.000 pg/ml. Il limite di rilevamento è di 22 pg/ml e il limite di quantizzazione (sensibilità funzionale) è di 29 pg/ml. Le variazioni intra- e inter-dosaggio a una concentrazione di sFlt-1 di 1540 pg/ml sono rispettivamente dello 0,3% e dello 0,8%; a 2988 pg/ml 0,5% e 1,1%; e a 9666 pg/ml 0,5% e 1,0%, rispettivamente. Il test KRYPTOR PlGF copre un intervallo di misurazione di 3,6-7,000 pp/ml. Il limite di rilevamento è 3,6 pg/ml e il limite di quantificazione è 6,9 pg/ml. Le variazioni intra- e inter-dosaggio a una concentrazione di PlGF di 35 pg/ml sono rispettivamente del 4,6% e del 7,3%; a 103 pg/ml 2,1% e 3,1% e a 430 pg/ml 0,9% e 2,3%, rispettivamente.
• Le misurazioni per i test Elecsys sFlt-1 e PIGF sono state eseguite sul sistema Elecsys completamente automatizzato (Elecsys, Penzberg, Germania) secondo le istruzioni del produttore. I dosaggi Elecsys sono immunodosaggi a sandwich basati sulla tecnologia dell'elettrochemiluminescenza. La durata totale delle analisi è di 18 minuti e il volume del campione è di 20 µl per sFlt-1 e 50 µl per PIGF. I dosaggi sono calibrati con PIGF umano ricombinante e sFlt-1 e standardizzati contro Quantikine PIGF e vascular endothelial growth factor-R1 ELISA (R&D Systems, Minneapolis, MN). Secondo le istruzioni per l'uso del produttore, il test Elecsys sFlt-1 copre un intervallo di misurazione da 10 a 85.000 pg/ml, il test Elecsys PIGF da 3 a 10.000 pg/ml. Il limite di rilevazione è 10 pg/ml (sFlt-1) e 3 pg/ml (PIGF). Il limite di quantizzazione è 15 pg/ml per sFlt-1 e 10 pg/ml per PIGF.

La vitamina D e lo studio sui marcatori angiogenici 1:

Vitamina D e marcatori angiogenici all'inizio della gravidanza. Epidemiologia e associazioni con l'aborto spontaneo in gravidanza

• In 1728 campioni di siero raccolti all'inizio della gravidanza, i livelli sierici di 25(OH)D sono stati studiati mediante LC-MS/MS e i livelli di sFlt-1 e PlGF sono stati determinati mediante test immunologici in 1720 campioni. Le informazioni del questionario e della cartella clinica sono state utilizzate per determinare i fattori che erano influenti sui livelli di 25(OH)D e sFlt/PlGF all'inizio della gravidanza mediante regressione lineare multipla e regressione logistica.
• In 1675 campioni di siero raccolti prima dell'età gestazionale 22+0 settimane, è stata eseguita un'analisi per valutare le proprietà predittive dei livelli di sFlt-1 e PlGF come biomarcatori di aborto spontaneo (n=59).
• In 1684 campioni di siero raccolti prima dell'età gestazionale 22+0 settimane, i livelli di 25(OH)D sono stati confrontati tra le donne che successivamente hanno subito aborti spontanei (n=59) e il resto della popolazione, corretti per selezionate covariate.