Vitamin D og angiogene markører i Odense Child Cohort 1 (VITAM)

Samlet: Odense Child Cohort Study (OCC) er en populasjonsbasert kohortstudie som omfatter gravide kvinner rekruttert mellom 1. januar 2010 og 31. desember 2012. Alle kvinner som var gravide i Odense kommune i løpet av denne tiden var kvalifisert for deltakelse, og 6 707 kvinner ble kontaktet direkte med rekrutteringsmateriell.

Studien var i samsvar med Helsingfors-erklæringen og ble godkjent av den regionale vitenskapsetiske komité for Syddanmark, nr. S-20090130. Alle deltakerne ga informert samtykke. Fra en befolkningsbase på 6 707 gravide kvinner meldte 2 874 (42,9 %) seg inn i OCC frem til 31. desember 2012. Barna vil følges frem til fylte 18 år.

Serumprøver ble tatt tidlig i svangerskapet (GA 2-25 uker), sent i svangerskapet (GA 26-30 uker), mors serum og navlestrengsblod ved fødselen, og fra barna sammen med generelle undersøkelser i alderen 3 måneder, 1 år, 3 år.

Spørreskjemaer ble fylt ut av familiene tidlig i svangerskapet, sent i svangerskapet, etter fødselen og ved tidspunktene for klinisk undersøkelse av barna.

Registerdata om helsevariabler var videre tilgjengelig fra de danske registrene.

Mål: Vitamin D og angiogen markørstudie 1 undersøker forholdet mellom serumbiomarkører 25(OH)D og løselig Fms-lignende kinase 1 (sFlt-1) og placental vekstfaktor (PlGF) under graviditet og risiko for spontanabort som et uheldig resultat tidlig i svangerskapet.

Metode:

• 25(OH)D-analyse: Serum ble lagret ved -80º Celsius frem til analyse, som ble utført ved væskekromatografi massespektrometri (LC-MS/MS). Trippel deuterium merket 25(OH) vitamin D3 ble tilsatt serumprøver som intern standard og deproteinisert med ZnSO4 i metanol, sentrifugert ved 2750 g i 10 minutter, og 100 μl ble injisert på TurboFlow-kolonnen (Thermo Scientific) på LC-MS /MS. LC-MS/MS besto av et Thermo Scientific TLX1-system koblet til en Thermo Scientific Vantage TSQ. 25(OH)D2 og 25(OH)D3 ble konsentrert på en Thermo Scientific Cyclone P 50 x 1,0 mm kolonne og tilbakespylet på analytisk kolonne, Phenomenex Gemini C18 50 x 3,0 mm og eluert fra analysekolonnen med en gradient. Mobile faser var A: 10 mM NH4Ac i vann og B: 10 mM NH4Ac i metanol. Humant serum ble tilsatt passende mengder 25(OH)D2 og 25(OH)D3 for å produsere sekspunkts kalibreringskurver (veid 1/x2) og 3 nivåer av QC-prøver (lav, middels, høy). Metoden ble kalibrert mot NIST-standard 972.25 C3-epimeren til D3 ble påvist sammen med D3, og de to kunne ikke skilles fra hverandre. Laveste påvisbare konsentrasjoner var 0,15 nM for både D2 og D3. Verdiene for D2 og D3 ble bare vurdert hvis de var over 6,5 nM.
• Målinger for BRAHMS sFlt-1 og PIGF KRYPTOR-analyser ble utført på det helautomatiske KRYPTOR compact Plus-systemet (KRYPTOR PlGF og KRYPTOR sFlt-1; Thermo Fisher Scientific) i henhold til produsentens instruksjoner. BRAHMS sFlt-1- og PlGF KRYPTOR-analysene er homogene sandwich-immunoanalyser basert på Trace-teknologien24. Den totale varigheten av analysene er 9 minutter (sFlt-1) og 29 minutter (PlGF) og prøvevolumet er henholdsvis 9 µl og 70 µl. Analysene er kalibrert med rekombinant human sFlt-1 og PIGF og standardisert mot Quantikine PIGF ELISA (R&D Systems Europe Ltd, Abingdon, Storbritannia) og mot sFlt-1 Elecsys-analysen (Elecsys, Penzberg, Tyskland). I henhold til produsentens bruksanvisning dekket KRYPTOR sFlt-1-analysen et måleområde på 22-90 000 pg/ml. Deteksjonsgrensen er 22 pg/ml og grensen for kvantisering (funksjonell sensitivitet) er 29 pg/ml. Intra- og interanalysevariasjonene ved en sFlt-1-konsentrasjon på 1540 pg/ml er henholdsvis 0,3 % og 0,8 %; ved 2988 pg/ml 0,5% og 1,1%; og ved 9666 pg/ml henholdsvis 0,5 % og 1,0 %. KRYPTOR PlGF-analysen dekker et måleområde på 3,6-7.000 pg/ml. Deteksjonsgrensen er 3,6 pg/ml og grensen for kvantifisering er 6,9 pg/ml. Intra- og interanalysevariasjonene ved en PlGF-konsentrasjon på 35 pg/ml er henholdsvis 4,6 % og 7,3 %; ved 103 pg/ml henholdsvis 2,1 % og 3,1 %, og ved 430 pg/ml 0,9 % og 2,3 %.
• Målinger for Elecsys sFlt-1- og PIGF-analyser ble utført på det helautomatiske Elecsys-systemet (Elecsys, Penzberg, Tyskland) i henhold til produsentens instruksjoner. Elecsys-analysene er sandwich-immunoanalyser basert på elektrokjemiluminescensteknologi. Den totale varigheten av analysene er 18 minutter og prøvevolumet er 20 µl for sFlt-1 og 50 µl for PIGF. Analysene er kalibrert med rekombinant human PIGF og sFlt-1 og standardisert mot Quantikine PIGF og vaskulær endotelial vekstfaktor-R1 ELISA (R&D Systems, Minneapolis, MN). I henhold til produsentens bruksanvisning dekker Elecsys sFlt-1-analysen et måleområde fra 10-85 000 pg/ml, Elecsys PIGF-analysen fra 3-10 000 pg/ml. Deteksjonsgrensen er 10 pg/ml (sFlt-1) og 3 pg/ml (PIGF). Kvantiseringsgrensen er 15 pg/ml for sFlt-1 og 10 pg/ml for PIGF.

Vitamin D og angiogen markørstudie 1:

Vitamin D og angiogene markører tidlig i svangerskapet. Epidemiologi og assosiasjoner til abort tidlig i svangerskapet

• I 1728 serumprøver samlet tidlig i svangerskapet, ble nivåene av serum 25(OH)D undersøkt med LC-MS/MS og nivåer av sFlt-1 og PlGF ble bestemt ved immunanalyser i 1720 prøver. Spørreskjema og medisinsk filinformasjon ble brukt til å bestemme faktorene som hadde innflytelse på 25(OH)D-nivåer og sFlt/PlGF tidlig i svangerskapet ved multippel lineær regresjon og logistisk regresjon.
• I 1675 serumprøver samlet før svangerskapsalder 22+0 uker, ble analyser utført for å evaluere de prediktive egenskapene til sFlt-1- og PlGF-nivåer som biomarkører for spontanabort (n=59).
• I 1684 serumprøver samlet før svangerskapsalder 22+0 uker, ble nivåene av 25(OH)D sammenlignet mellom kvinner som senere fikk spontanaborter (n=59) og resten av befolkningen, korrigert for utvalgte kovariater.