D-vitamin og angiogene markører i Odense Child Cohorte 1 (VITAM)

Overordnet set: Odense Child Cohort Study (OCC) er et befolkningsbaseret kohortestudie, der omfatter gravide kvinder rekrutteret mellem 1. januar 2010 og 31. december 2012. Alle kvinder, der i denne tid var gravide i Odense kommune, var berettigede til at deltage, og 6.707 kvinder blev kontaktet direkte med rekrutteringsmateriale.

Undersøgelsen var i overensstemmelse med Helsinki-deklarationen og blev godkendt af Regional Videnskabsetisk Komité for Syddanmark, nr. S-20090130. Alle deltagere gav informeret samtykke. Fra en befolkningsbase på 6.707 gravide kvinder tilmeldte 2.874 (42,9%) sig til OCC frem til 31. december 2012. Børnene vil blive fulgt indtil 18 år.

Serumprøver blev taget i tidlig graviditet (GA 2-25 uger), sen graviditet (GA 26-30 uger), moderens serum og navlestrengsblod ved fødslen og fra børnene sammen med generelle undersøgelser i alderen 3 måneder, 1 år, 3 flere år.

Spørgeskemaer blev udfyldt af familierne i tidlig graviditet, sen graviditet, efter fødslen og på tidspunkterne for klinisk undersøgelse af børnene.

Registerdata om sundhedsvariable var yderligere tilgængelige fra de danske registre.

Formål: Vitamin D og angiogen markørstudie 1 undersøger forholdet mellem serum biomarkører 25(OH)D og opløselig Fms-lignende kinase 1 (sFlt-1) og placenta vækstfaktor (PlGF) under graviditet og risiko for abort som et negativt resultat tidligt i graviditeten.

Metode:

• 25(OH)D-analyse: Serum blev opbevaret ved -80º Celsius indtil analyse, som blev udført ved væskekromatografi massespektrometri (LC-MS/MS). Triple deuterium mærket 25(OH) vitamin D3 blev tilsat til serumprøver som intern standard og deproteiniseret med ZnSO4 i methanol, centrifugeret ved 2750 g i 10 minutter, og 100 μl blev injiceret på TurboFlow kolonnen (Thermo Scientific) på LC-MS /FRK. LC-MS/MS bestod af et Thermo Scientific TLX1-system forbundet til en Thermo Scientific Vantage TSQ. 25(OH)D2 og 25(OH)D3 blev koncentreret på en Thermo Scientific Cyclone P 50 x 1,0 mm søjle og skyllet tilbage på den analytiske søjle, Phenomenex Gemini C18 50 x 3,0 mm og elueret fra den analytiske søjle med en gradient. Mobile faser var A: 10 mM NH4Ac i vand og B: 10 mM NH4Ac i methanol. Humant serum blev tilsat passende mængder af 25(OH)D2 og 25(OH)D3 for at producere sekspunktskalibreringskurver (vejet 1/x2) og 3 niveauer af QC-prøver (lav, mellem, høj). Metoden blev kalibreret mod NIST standard 972.25 C3-epimeren af ​​D3 blev påvist sammen med D3, og de to kunne ikke skelnes fra hinanden. Laveste påviselige koncentrationer var 0,15 nM for både D2 og D3. Værdier af D2 og D3 blev kun taget i betragtning, hvis de var over 6,5 nM.
• Målinger for BRAHMS sFlt-1 og PIGF KRYPTOR-assays blev udført på det fuldautomatiske KRYPTOR compact Plus-system (KRYPTOR PlGF og KRYPTOR sFlt-1; Thermo Fisher Scientific) i henhold til producentens instruktioner. BRAHMS sFlt-1- og PlGF KRYPTOR-assays er homogene sandwich-immunoassays baseret på Trace-teknologien24. Den samlede varighed af assays er 9 minutter (sFlt-1) og 29 minutter (PlGF), og prøvevolumenet er henholdsvis 9 µl og 70 µl. Assayene er kalibreret med rekombinant human sFlt-1 og PIGF og standardiseret mod Quantikine PIGF ELISA (R&D Systems Europe Ltd, Abingdon, UK) og mod sFlt-1 Elecsys assay (Elecsys, Penzberg, Tyskland). Ifølge producentens brugsanvisning dækkede KRYPTOR sFlt-1-analysen et måleområde på 22-90.000 pg/ml. Detektionsgrænsen er 22 pg/ml og grænsen for kvantisering (funktionel følsomhed) er 29 pg/ml. Intra- og inter-assay-variationerne ved en sFlt-1-koncentration på 1540 pg/ml er henholdsvis 0,3 % og 0,8 %; ved 2988 pg/ml 0,5% og 1,1%; og ved 9666 pg/ml henholdsvis 0,5 % og 1,0 %. KRYPTOR PlGF-analysen dækker et måleområde på 3,6-7.000 pg/ml. Detektionsgrænsen er 3,6 pg/ml, og grænsen for kvantificering er 6,9 pg/ml. Intra- og inter-assay-variationerne ved en PlGF-koncentration på 35 pg/ml er henholdsvis 4,6 % og 7,3 %; ved 103 pg/ml henholdsvis 2,1% og 3,1% og ved 430 pg/ml henholdsvis 0,9% og 2,3%.
• Målinger for Elecsys sFlt-1- og PIGF-assays blev udført på det fuldautomatiske Elecsys-system (Elecsys, Penzberg, Tyskland) i henhold til producentens instruktioner. Elecsys-assays er sandwich-immunoassays baseret på elektrokemiluminescensteknologi. Den samlede varighed af assayene er 18 minutter, og prøvevolumenet er 20 µl for sFlt-1 og 50 µl for PIGF. Assayene er kalibreret med rekombinant human PIGF og sFlt-1 og standardiseret mod Quantikine PIGF og vaskulær endotelvækstfaktor-R1 ELISA'er (R&D Systems, Minneapolis, MN). Ifølge producentens brugsanvisning dækker Elecsys sFlt-1-analysen et måleområde fra 10-85.000 pg/ml, Elecsys PIGF-analysen fra 3-10.000 pg/ml. Detektionsgrænsen er 10 pg/ml (sFlt-1) og 3 pg/ml (PIGF). Kvantiseringsgrænsen er 15 pg/ml for sFlt-1 og 10 pg/ml for PIGF.

D-vitamin og angiogen markørundersøgelse 1:

D-vitamin og angiogene markører i tidlig graviditet. Epidemiologi og associationer til abort tidligt i graviditeten

• I 1728 serumprøver indsamlet tidligt i graviditeten blev niveauerne af serum 25(OH)D undersøgt ved LC-MS/MS, og niveauer af sFlt-1 og PlGF blev bestemt ved immunoassays i 1720 prøver. Spørgeskema og medicinsk filoplysninger blev brugt til at bestemme de faktorer, der havde indflydelse på 25(OH)D-niveauer og sFlt/PlGF i tidlig graviditet ved multipel lineær regression og logistisk regression.
• I 1675 serumprøver indsamlet før gestationsalder 22+0 uger, blev der udført analyse for at evaluere de prædiktive egenskaber af sFlt-1 og PlGF niveauer som biomarkører for abort (n=59).
• I 1684 serumprøver indsamlet før gestationsalder 22+0 uger, blev niveauerne af 25(OH)D sammenlignet mellem kvinder, der efterfølgende led af spontane aborter (n=59) og resten af ​​befolkningen, korrigeret for udvalgte kovariater.