Vitamina D e marcadores angiogênicos em Odense Child Cohort 1 (VITAM)

Geral: O Odense Child Cohort Study (OCC) é um estudo de coorte de base populacional, compreendendo mulheres grávidas recrutadas entre 1º de janeiro de 2010 e 31 de dezembro de 2012. Todas as mulheres que estavam grávidas no município de Odense durante esse período foram elegíveis para participação e 6.707 mulheres foram abordadas diretamente com material de recrutamento.

O estudo atendeu à declaração de Helsinque e foi aprovado pelo Comitê Regional de Ética Científica para o Sul da Dinamarca, no. S-20090130. Todos os participantes deram consentimento informado. De uma base populacional de 6.707 gestantes, 2.874 (42,9%) se inscreveram no ACO até 31 de dezembro de 2012. As crianças serão acompanhadas até os 18 anos.

Amostras de soro foram coletadas no início da gravidez (GA 2-25 semanas), no final da gravidez (GA 26-30 semanas), soro materno e sangue do cordão umbilical no nascimento e das crianças junto com exames gerais nas idades de 3 meses, 1 ano, 3 anos.

Os questionários foram preenchidos pelas famílias no início da gravidez, no final da gravidez, após o nascimento e nos momentos de exame clínico das crianças.

Dados de registro sobre variáveis ​​de saúde também estavam disponíveis nos registros dinamarqueses.

Objetivo: O Estudo 1 de Vitamina D e Marcador Angiogênico examina a relação entre os biomarcadores séricos 25(OH)D e a quinase 1 semelhante a FMS solúvel (sFlt-1) e o fator de crescimento placentário (PlGF) na gravidez e o risco de aborto espontâneo como resultado adverso no início da gravidez.

Método:

• Análise de 25(OH)D: O soro foi armazenado a -80º Celsius até a análise, que foi realizada por espectrometria de massas por cromatografia líquida (LC-MS/MS). Triplo deutério marcado com 25(OH)vitamina D3 foi adicionado às amostras de soro como padrão interno e desproteinizado com ZnSO4 em metanol, centrifugado a 2750 g por 10 minutos e 100 μl foram injetados na coluna TurboFlow (Thermo Scientific) no LC-MS /EM. O LC-MS/MS consistia em um sistema Thermo Scientific TLX1 conectado a um Thermo Scientific Vantage TSQ. 25(OH)D2 e 25(OH)D3 foram concentrados em uma coluna Thermo Scientific Cyclone P 50 x 1,0 mm e retrolavados na coluna analítica Phenomenex Gemini C18 50 x 3,0 mm e eluídos da coluna analítica por um gradiente. As fases móveis foram A: NH4Ac 10 mM em água e B: NH4Ac 10 mM em metanol. O soro humano foi adicionado com quantidades apropriadas de 25(OH)D2 e 25(OH)D3 para produzir curvas de calibração de seis pontos (pesado 1/x2) e 3 níveis de amostras QC (baixo, médio, alto). O método foi calibrado contra o padrão NIST 972.25 O epímero C3 de D3 foi detectado junto com D3 e os dois não foram distinguíveis um do outro. As concentrações detectáveis ​​mais baixas foram de 0,15 nM para D2 e ​​D3. Valores de D2 e ​​D3 só foram considerados se acima de 6,5 nM.
• As medições para os ensaios BRAHMS sFlt-1 e PIGF KRYPTOR foram realizadas no sistema KRYPTOR compact Plus totalmente automatizado (KRYPTOR PlGF e KRYPTOR sFlt-1; Thermo Fisher Scientific) de acordo com as instruções do fabricante. Os ensaios BRAHMS sFlt-1 e PlGF KRYPTOR são imunoensaios sanduíche homogêneos baseados na tecnologia Trace24. A duração total dos ensaios é de 9 minutos (sFlt-1) e 29 minutos (PlGF) e o volume da amostra é de 9 µl e 70 µl, respectivamente. Os ensaios são calibrados com sFlt-1 humano recombinante e PIGF e padronizados contra o Quantikine PIGF ELISA (R&D Systems Europe Ltd, Abingdon, Reino Unido) e contra o ensaio sFlt-1 Elecsys (Elecsys, Penzberg, Alemanha). De acordo com as instruções de uso do fabricante, o ensaio KRYPTOR sFlt-1 abrange uma faixa de medição de 22-90.000 pg/ml. O limite de detecção é de 22 pg/ml e o limite de quantização (sensibilidade funcional) é de 29 pg/ml. As variações intra e interensaio a uma concentração de sFlt-1 de 1540 pg/ml são de 0,3% e 0,8%, respectivamente; a 2988 pg/ml 0,5% e 1,1%; e a 9666 pg/ml 0,5% e 1,0%, respectivamente. O ensaio KRYPTOR PlGF cobre uma faixa de medição de 3,6-7,000 pg/ml. O limite de detecção é de 3,6 pg/ml e o limite de quantificação é de 6,9 ​​pg/ml. As variações intra- e inter-ensaio a uma concentração de PlGF de 35 pg/ml são 4,6% e 7,3%, respectivamente; a 103 pg/ml 2,1% e 3,1%, e a 430 pg/ml 0,9% e 2,3%, respectivamente.
• As medições para os ensaios Elecsys sFlt-1 e PIGF foram realizadas no sistema Elecsys totalmente automatizado (Elecsys, Penzberg, Alemanha) de acordo com as instruções do fabricante. Os ensaios Elecsys são imunoensaios sanduíche baseados na tecnologia de eletroquimioluminescência. A duração total dos ensaios é de 18 minutos e o volume da amostra é de 20 µl para sFlt-1 e 50 µl para PIGF. Os ensaios são calibrados com PIGF humano recombinante e sFlt-1 e padronizados contra Quantikine PIGF e fator de crescimento endotelial vascular-R1 ELISAs (R&D Systems, Minneapolis, MN). De acordo com as instruções de uso do fabricante, o ensaio Elecsys sFlt-1 cobre uma faixa de medição de 10-85.000 pg/ml, o ensaio Elecsys PIGF de 3-10.000 pg/ml. O limite de detecção é 10 pg/ml (sFlt-1) e 3 pg/ml (PIGF). O limite de quantização é de 15 pg/ml para sFlt-1 e 10 pg/ml para PIGF.

O Estudo de Vitamina D e Marcador Angiogênico 1:

Vitamina D e marcadores angiogênicos no início da gravidez. Epidemiologia e associações com aborto espontâneo precoce

• Em 1.728 amostras de soro coletadas no início da gravidez, os níveis séricos de 25(OH)D foram investigados por LC-MS/MS e os níveis de sFlt-1 e PlGF foram determinados por imunoensaios em 1.720 amostras. As informações do questionário e do prontuário médico foram usadas para determinar os fatores que influenciaram os níveis de 25(OH)D e sFlt/PlGF no início da gravidez por regressão linear múltipla e regressão logística.
• Em 1.675 amostras de soro coletadas antes da idade gestacional 22+0 semanas, a análise foi realizada para avaliar as propriedades preditivas dos níveis de sFlt-1 e PlGF como biomarcadores de aborto espontâneo (n=59).
• Em 1.684 amostras de soro coletadas antes da idade gestacional de 22+0 semanas, os níveis de 25(OH)D foram comparados entre mulheres que sofreram abortos espontâneos subseqüentemente (n=59) e o restante da população, corrigida para covariáveis ​​selecionadas.